デュプレックスデジタルPCRによるデュアル遺伝マーカーの同時定量

要約

出典:Cao, Y., et al.Enterococcus sppの同時定量のためのデュプレックスデジタルPCRアッセイ。水中のヒト糞便関連HF183マーカー。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオでは、デュプレックスデジタルPCR(ddPCR)技術を示しています。これは、従来のPCR技術の修正版で、2つの異なる遺伝子マーカーを同時に検出するのに役立ちます。1つのPCR反応をナノリットルサイズの乳化液滴に分割し、それぞれに増幅し、液滴画分から異なる色の蛍光増幅シグナルを検出することで、標的配列の初期濃度を算出します。

プロトコル

1. アッセイ混合物の調製

1. 分子グレードの水およびプローブ中のすべてのプライマーについて、100 μmol/L のストック濃度を TE pH 8 バッファー [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ;HF183-1, BthetR1, BthetP].
   注:2つのターゲットのプローブは、材料/機器のリストに示されているように、異なる蛍光色素で蛍光標識されています。
2. 計画された反応ごとに、12 μLのデジタルPCRミックス(2倍ストック、材料/機器のリストを参照)、フォワードプライマーとリバースプライマー各0.216 μl、蛍光プローブ各0.06 μl、およびヌクレアーゼフリー水5.016 μl(最終濃度:プライマー各900 nM、各プローブ250 nM)を、計画された反応ごとに混合してマスターミックスを調製します。溶液に気泡が入らないように注意しながら、少なくとも10回ピペットで上下させて混合します。
3. 18 μlのマスターミックス(ステップ1.2から)を通常のPCRチューブまたはプレートにピペットで移し、6 μlのDNAテンプレート(前述のように抽出)で混合して、液滴生成用のアッセイ混合物を作製します。サンプルを重複して分析する場合は、36 μlのマスターミックスと12 μlのDNAテンプレートを各ウェルにピペットで入れます。プレート上の対応するレプリケートウェルを空のままにします。ポジティブコントロール(材料/機器のリストを参照)とテンプレートコントロールなし(NTC)(つまり、テンプレートとして分子グレードの水を使用)を含めます。
   手記：アッセイが適切に実行されていることを確認するためにはポジティブコントロールが必要であり、プレート内に汚染がないことを確認し、データ解析の後半で蛍光ベースラインを設定するためにはNTCが必要です。初めての方は、希釈されていないDNAサンプルと希釈されたDNAサンプルの両方を使用することをお勧めします。

2. 液滴生成とPCRプレートのセットアップ

1. マルチチャンネルピペットを使用して約15回ピペッティングしてアッセイ混合物を混合します。混合物内に過剰な気泡を作らないように、ピペットの先端が液体内に留まっていることを確認してください。
2. カートリッジ 1 (8 ウェルを含む) を白いカートリッジホルダーに挿入し、カートリッジホルダーをカチッと閉めます。これでカートリッジ1がしっかりと固定され、液滴が発生してもホルダーから外れることはありません。マルチチャンネルピペットを使用して、気泡を生じさせずに、20 μlのアッセイ混合物を「Sample」と記されたカートリッジの中央位置に静かに移します。
3. 液滴発生オイル70μlをカートリッジの左側(「Oil」とマークされています)にピペットで
入れます。
4. カートリッジをガスケットで覆い、ガスケットが平らで、カートリッジの端に向かって4ティックで均等に保持されていることを確認します。液滴発生器の緑色に点灯しているボタンを押して、カートリッジを開いて配置します。緑色の点灯したボタンをもう一度押すと、発電機が閉じます.
   手記：ドアが閉まると、ボタンが暗くなり、ドアを再度開くことはできなくなり、すぐに液滴の発生が約1分間続きます。
5. 8回を超える反応を行う場合は、カートリッジ2を2つ目の白いカートリッジホルダーに入れ、液滴生成の進行中にカートリッジ1と同じ方法で調製すると、合計セットアップ時間を節約できます。
6. 薄暗いボタンが緑色に変わり、液滴生成が完了したことを示すときに、液滴発生器のドアを開きます。カートリッジ 1 が入っている白いカートリッジ・ホルダーを取り外して脇に置き、カートリッジ 2 を液滴発生器の上に置きます。
7. カートリッジ 1 からガスケットを取り外し、廃棄します。カートリッジの3列目(「Droplets」とマークされています)から生成された液滴の総量(約40 μl)を、サーマルサイクリング用の最終PCRプレート(室温に維持)に静かに移します><。 手記：白いカートリッジホルダーのクリックを外すと、新しく生成された液滴が壊れる可能性があるため、クリックを外さないでください。カートリッジホルダーを開けるのは、液滴が最終プレートに移された後のみです。
8. 追加のサンプルについて、手順2.1〜2.7を繰り返します。
9. すべての液滴が最終PCRプレートに入ったら、プレートの上にピアス可能なホイルカバーを置き、プレートシーラーの上に置きます。シーラーを180°Cに設定し、シーラーの「Play」を押して10秒間シールします。

3. 熱サイクルと液滴読み取り

1. 密封されたプレートを、ステップ2.7で使用した最終PCRプレートと互換性があり、温度上昇速度が2.0°C/秒のサーマルサイクラーに置きます。
2. サーマルプログラムは、95 °Cで10分間、94 °Cで30秒、60 °Cで60秒を40サイクル繰り返し、98 °Cで10分間保持します(オプション:4 °Cまたは15 °Cでの最終保持
)。
3. サイクリングが完了したら、プレートを液滴リーダーに移し、各ウェルの各液滴の蛍光を自動的に測定します。または、液滴を読み取る前に、プレートを4°Cで最大3日間保存してください。読み取りに進む前に、液滴が室温にあることを確認してください。
   1. 付属のソフトウェアを開いて、液滴読み取りを設定します。空の96ウェルプレートの概略図を含むデフォルトの「Setup」メニューで、ウェルA1をダブルクリックして、「Sample」、「Assay 1」、「Assay 2」の3つのセクションを含むメニューを開きます。
   2. 「Sample」セクションで、「Name」と書かれたボックスにサンプルIDを入力してEnterキーを押すか、右側の「Apply」と書かれたボックスにチェックを入れます。次に、「Experiment」というラベルのドロップダウンメニューをクリックし、「RED」(レアイベント検出)を選択し、Enterキーを押します。
   3. 「Assay 1」と書かれたセクションに移動し、「Name」セクションでアッセイ(例:Enterococcus)を記入し、Enterをクリックします。「タイプ」というラベルの付いた下のボックスで、ドロップダウンメニューをクリックし、「Channel 1 Unknown」を選択してEnterキーを押します。
   4. 「Assay 2」と書かれたセクションに移動し、「Name」セクションでアッセイ(HF183など)を記入し、Enterをクリックします。「タイプ」というラベルの付いた下のボックスで、ドロップダウンメニューをクリックし、「チャンネル2不明」を選択してEnterキーを押します。ステップ 3.3.2 から 3.3.4 までのすべての情報がウェル A1 に存在するようになりました。
   5. 液滴を含むすべての後続のウェルに名前を付けます。合計セットアップ時間を節約するには、「Shift」または「Ctrl」をクリックして、複数のウェルを同時に選択します。
   6. プレートのデジタル描写が物理プレートを反映している場合は、メニューの右下にある[OK]を押します。プレート回路図の上部に表示される新しいメニューの[テンプレート]セクションで、[名前を付けて保存]を選択し、プレートに名前を付けて保存します。
   7. 画面の左側にある「実行」をクリックし、ポップアウトの「実行オプション」ウィンドウで適切な染料セットを選択します。データ収集が開始され、ソフトウェアにリアルタイムで表示されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
低結合マイクロチューブ	共演者	3207	試薬、サンプルの保管/マスターミックスの作製に
ヌクレアーゼフリーウォーター	フィッシャーサイ	BP2484-50
TE pH 8 バッファー	フィッシャーサイ	BP2473-100
ハードシェル96ウェルプレート	バイオラッド	HSP-9601	初期マスターミックスおよびサンプル接種用
アルミシーリングフィルム	バイオラッド	〒359-0133	サンプルプレートをシールするには
液滴発生器	バイオラッド	〒186-3002
液滴発生油	バイオラッド	〒186-3005
カートリッジ	バイオラッド	〒186-4008
DG8カートリッジホルダー	バイオラッド	〒186-3051
ガスケット	バイオラッド	〒186-3009
20uLピペットチップ	レイニン	GP-L10Fの	サンプル/マスターミックスからカートリッジへのタンフェリング用
200uLピペットチップ	レイニン	GP-L200Fの	液滴を最終的なTwin.Tecプレートに移すため
Twin.Tec 96ウェルプレート	エッペンドルフ	951020320	最終的な液滴の熱サイクルと読み取り
ピアス可能なヒートシールホイル	バイオラッド	〒181-4040	サーマルサイクルの前にTwin.Tecプレートをシールするため
PX1 PCRプレートシーラー	バイオラッド	181-4000	サーマルサイクラーのみが必要で、光学系は必要ありません
CFX96 サーマルサイクラー	バイオラッド	CFX96およびC1000
QX100 ドロップレットリーダー	バイオラッド	〒186-3001
液滴リーダーオイル	バイオラッド	〒186-3004
ドロップレットPCRスーパーミックス	バイオラッド	〒186-3024	つまり、原稿のデジタルPCRミックス
QuantaSoftソフトウェア(v1.3.2)	クアンタソフト	QX100	ddPCRデータの表示、分析、エクスポート
エンテロフォワードプライマー(Ent F1A)	オペロン	ガガーアアッチャアアックガacttg	代替ベンダーを使用することができます
エンテロリバースプライマー(Ent R1)	オペロン	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	代替ベンダーを使用することができます
エンテロプローブ (GPL813TQ)	オペロン	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA タグ CTT タグ GGC TA-[BHQ1]	代替ベンダーを使用することもできますが、蛍光色素はFAMである必要があります
HF183 フォワードプライマー (HF183-1)	オペロン	アトガグトカッチャットグッチャッコッ	代替ベンダーを使用することができます
HF183リバースプライマー(BthetR1)	オペロン	CGTAGGAGTTTGGACCGTGTさん	代替ベンダーを使用することができます
HF183プローブ(BthetP1)	オペロン	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC アカッガガ-[BHQ1]	別のベンダーを使用することもできますが、蛍光色素はHEXである必要があります(VICを使用する場合は、適切なマトリックコンペンセーションを選択する必要があります)。
ポジティブコントロール			E.faecalisゲノムDNAとHF183標準プラスミドの混合物(IDTから注文)。E. faecalisの培養方法やHF183プラスミドの配列については、Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008)をご覧ください。市販のEnterococcus DNA標準(ATCC 29212Q-FZ)も、実験室で調製したE. faecalisゲノムDNAの代わりにポジティブコントロールに使用できます。