ウイルス感染の診断のためのリアルタイム定量的逆転写PCR

要約

出典:Marston, D. A. et al. Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、リアルタイムの逆転写PCRを使用してウイルス感染を検出するための定量的な方法を示しています。逆転写ステップでは、RNAがcDNAに変換され、PCRサイクルによって増幅されます。サンプル中のウイルスRNAの存在は、PCRから得られたDNAの増幅曲線と解離曲線を分析することによって確認されます。

プロトコル

1. 微量分光光度計によるRNAの定量

1. 分光光度計の設定がRNAに設定されていることを確認します。
2. 1〜2μLの分子グレードの水を使用して、マシンを初期化し、ベースラインを設定します。
3. 各試験RNAサンプルを1〜2μL使用して、RNA量を評価します。
4. 読み物とドキュメントを保存します。
5. 必要に応じて、RNAを1 μg/μLに調整します
   手記： RNAは常に氷の上(または冷たいブロック)に保管する必要があります。カラムまたはビーズベースの方法を使用してRNAを取得する場合、RNAは通常1μg/μL未満です。この状況では、きちんとしたRNAを使用してください。

2. エンドポイント感度を決定するためのRNA希釈系列の調製

1. RNAを10倍に段階希釈します。
   1. 希釈シリーズ(例:^10-1、^10-2など)とRNAの詳細をチューブにラベルします。
   2. 各チューブに45 μLの分子グレードの水を加えます。
   3. 5 μLのRNA(あらかじめ1 μg/μLに希釈)を加え、よく混合します。
   4. ピペットチップは適切な消毒剤に廃棄し、新しいチップと交換してください。
   5. ^10-1から5μLを取り出し、^10-2チューブに加えてよく混ぜます。
   6. 残りの希釈液で2.1.3-2.1.5を繰り返します.
      注:RNAは常に氷上(または冷たいブロック)に保管する必要があります。

3. リアルタイムRT-PCR反応の調製

1. スプレッドシートを使用して、リッサウイルスアッセイとβ-アクチンアッセイの両方について、テストサンプルとコントロールサンプルの数に応じてプレートレイアウトを計画します.
   手記： 4つのサンプルをポジティブコントロールとネガティブコントロールで重複してテストする場合、これは両方のアッセイで10回の反応に相当します。
2. 「クリーンルーム」またはRNAテンプレートとは別の場所で、使用前に適切な消毒剤で表面を拭くか、PCRワークステーション(使用している場合)を準備してください。ワークステーションを準備するには、適切な消毒剤でキャビネットの表面を拭き、必要なアイテムをワークステーションに入れてドアを閉めます。UVライトを10分間オンにします。
3. リージェントとプライマーを冷凍庫から取り出し、解凍します(表1に記載されている試薬と表2のプライマー).
   注:酵素ミックスはグリセロールで保存されるため、解凍する必要はなく、常に氷上(または冷たいブロック)に保管する必要があります。他のすべての試薬は室温で解凍できます。
4. 解凍したら、試薬と遠心分離機を短時間混合して液体を収集します.
   注:酵素ミックスをボルテックスせず、短時間遠心分離するだけです。
5. リッサウイルスとβ-アクチンのマスターミックスを別々に調製します。各反応について、7.55 μLの分子グレードの水、10 μLの2x Universal SYBR green反応ミックス、0.6 μLのフォワードプライマー、0.6 μLのリバースプライマー、0.25 μLのiTaq RT酵素ミックスを加えます。
   1. スプレッドシートを使用して正しい体積を計算し、手動計算のエラーを回避します。ピペッティングエラーを補うために十分なマスターミックスが準備されていることを確認してください。したがって、10回の反応が必要な場合(3.1の注を参照)、12個の反応を準備します
   2. マスターミックスを氷上(またはクールブロック)で準備し、リアルタイムマシンに入れるまで氷の上に留まります。
6. 調製したマスターミックスを混合し、短時間遠心分離し、19 μLをストリップチューブの関連ウェルまたは使用中のリアルタイムマシンと互換性のある96ウェルプレートに分注します。
   注:ピペッティング中のウェル内での気泡の生成を最小限に抑えてください。
7. 別の部屋、または3.2で説明したように準備したUVキャビネットで、適切なマスターミックスウェルの表面下に1μLのRNAを慎重に加えます(ステップ1.5を参照)。ピペットチップは使用後すぐに消毒液に捨ててください(表面の下)。
   1. テストサンプルの後にコントロールを追加し、次にポジティブコントロールを追加し、最後にテンプレートなしコントロール(NTC – 分子グレードの水)を追加します。使用するRNAの量は、サンプルの種類や使用するRNA抽出によって変更できます。反応が最適化されていることを確認するために、使用量を検証する必要があります。
8. ストリップの蓋またはシーラーを使用してプレートを密封し、すべての蓋がしっかりと閉じられ、サンプルの向きが十分に保たれていることを確認してください。プレート/ストリップチューブの端にラベルを付けます。
9. 遠心分離機を使用してサンプルをスピンダウンし、ウェルの底にあるすべての液体を収集します。
10. プレートをリアルタイムPCRマシンに移し、ドアを開けてホルダーに入れ、プレートのレイアウトに従ってサンプルの正しい位置/向きを確保します.
    注意: チューブストリップを使用する場合は、ホルダーが所定の位置にあることを確認してください。
11. リアルタイムPCRマシンプログラムを開き、解離曲線を使用したSYBRリアルタイム実験のオプションを選択します。データ収集ポイントを含む、表3に指定された熱サイクル条件を使用して、リアルタイムPCRマシンをプログラムします。
12. 蛍光色素としてSYBRを選択し、サンプルタイプとしてunknownを選択し、正しいサンプル名ボックスに名前を挿入します
    手記： 複製物と、リッサウイルスとβ-アクチンウェルを区別します。
13. 実験データを保存するファイルの場所を選択し、実行の終了時にランプがオフになることを確認してから、実行を開始します。
    注:最初のステップはRTステージであるため、この間データは収集されないため、ランプがウォームアップ期間を必要とする場合、これはRTステージ中に発生する可能性があります。リアルタイムマシンとソフトウェアは増幅曲線をリアルタイムで表示し、融解曲線はサイクルの終了時に生成されます。

結果

表1:汎リッサウイルスリアルタイムRT-PCRマスターミックス試薬。

名

試薬	μL/反応
分子グレードの水	7.55
2x ユニバーサル RT PCR 反応ミックス	10
プライマーフォワード [20 μM]	0.6
プライマーリバース [20 μM]	0.6
RT酵素ミックス	0.25
反応あ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アートバリアピペットチップ(各種サイズ)	サーモフィッシャー	諸
遠心機	ベックマン	アレグラ 21R	必要な96ウェルプレートを保持できるローター。ステップ 3.8.
遠心分離機(マイクロ)	シグマ
フィンピペット(0.5-1000μL分注用)	サーモフィッシャー	諸
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR キット	バイオ・ラッド	〒172-5150	バリデーションされた場合は、同等のキットを使用できます
MX3000PまたはMX3005PリアルタイムPCRシステム	ストラタジーン	該当なし	検証された場合は、同等のマシンを使用できます
MicroAmpリアクションプレートベース	適切なもの		チューブストリップとプレートをしっかりと保持するために使用されます。
光学的に透明なフラットクリアストリップ (8)	アビーン	AB-0866
パーフェクトフィットフレーム(チューブストリップを使用している場合)	ストラタジーン	該当なし	マシン専用
プライマー:プライマーの詳細については、表2を参照してください。			0.05 μmolスケールのHPLC精製でご注文ください。
Thermo-Fast 96 ウェルプレート、ノンスカート	アビーン	AB-600
サーモファストストリップ (8) サーモチューブ	アビーン	AB-0452
ボルテックスマシン/ワーリミキサー	フィソンズサイエンティフィック機器	SGP-202-010J
明記されていない限り、代替機器を使用できます