低頻度の体細胞変異を検出するための野生型ブロッキングPCR

要約

出典:Albitar, A. Z. et al., Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオでは、体細胞変異を検出する野生型ブロッキングポリメラーゼ連鎖反応(WTB-PCR)について説明しています。PCRベースの手法では、相補的な野生型対立遺伝子に結合して伸長をブロックするオリゴヌクレオチドであるロック核酸(LNA)を使用します。ブロッキングにより、サンプル中の野生型バリアントに対する低レベルの変異対立遺伝子の増幅が選択的になります。

プロトコル

1. FFPE組織、末梢血、骨髄穿刺液からのDNA抽出

1. DNA FFPE抽出キットを備えた骨髄FFPE組織
   1. 未染色のスライド(厚さ5〜10μmの5〜10切片)からのFFPE組織から始めます
      手記：組織の削りくずから始める場合は、厚さ5〜10μmの3〜6切片を使用し、手順1.1.6にスキップします。
   2. スライドをスライドバスケットに入れ、4つのウォッシュリザーバー(キシレン用に2つ、100%アルコール用に2つ)を準備します。各バスケットに最小容量の600 mLの溶液を追加します。
   3. スライドを脱パラフィンするには、最初のトレイで5分間キシレン洗浄を行います。スライドを2番目のキシレンウォッシュリザーバーにさらに5分間移します。
   4. 脱パラフィン後、スライドを100%アルコールで5分間洗浄し、スライドを2番目のアルコール洗浄リザーバーにさらに5分間移します。
   5. スライドをフードの下で完全に乾かしてから、かみそりの刃でマイクロ遠心チューブにこすり落とします.
      手記：腫瘍領域が示されたH&Eスライドが利用可能な場合は、スライドを位置合わせし、腫瘍領域のみをこすり落とします。
   6. キットに含まれている製造元の配布資料の指示に従って進めてください。
2. BM吸引液および末梢血用
   1. これらの仕様で製造元の配布資料に従って抽出します.
      手記：FFPE組織や細胞からのDNA抽出には、数多くの市販のキットや方法があります。実際には、すべて使用できます。実験室で確立された方法を使用してください。
      1. 200 μLの末梢血(PB)または100 μL BM + 100 μL PBSを使用します。
      2. 4 μL RNase Aストック溶液を使用してください。
      3. 100 μLの溶出バッファーで溶出します。
3. DNA定量
   1. 分光光度計を使用してDNA濃度を測定し、260 nm/280 nmの比が約1.8(純粋なDNAの場合)であることを確認します。この比率がかなり低い場合は、タンパク質、フェノール、または下流のアプリケーションに干渉する可能性のあるその他の汚染物質が存在することを示している可能性があります。
   2. 適切な溶出バッファーを使用して、DNA濃度を約50〜100 ng/μLに調整します。

2. 野生型ブロッキングPCR

1. プライマーデザイン
   1. 前述のPCRプライマー設計の一般的なガイドラインに従って、目的の遺伝子のプライマーを設計し、取得します。PCRプライマーにM13フォワードおよびリバースユニバーサルシーケンシングプライマーを含める.
      手記：MYD88アッセイは、MYD88のエクソン5(G259 - N291)と5'イントロン領域に位置する110ヌクレオチドを増幅し、スプライス部位とイントロン4の一部をカバーするために開発されました。フォワードプライマーとリバースプライマーは、5'-M13シーケンス(M13-フォワード:tgt aaa acg acg gcc agt;M13-reverse: cag gaa aca gct atg acc)を使用して、相補的なシーケンシングプライマーのアニーリングを可能にします(材料表を参照)。
2. ロック核酸オリゴヌクレオチド設計
   1. ブロッキングオリゴヌクレオチドは、長さが約10〜15塩基で、変異体の濃縮が望まれるWTテンプレートに相補的になるように設計します。
      手記：オリゴが短いほど、ミスマッチの識別が改善されます。高い標的特異性を達成するためには、ブロッキングヌクレオチドを過剰に使用しないことが重要です。これは、非常に「粘着性のある」オリゴヌクレオチドになる可能性があるためです。含有量、長さ、ブロッキングヌクレオチドは、ブロックする必要のある特定のヌクレオチドに応じて最適化する必要があります。二次構造を損なうことなく、また自己相補性を危険にさらすことなく、高い結合特異性を達成することが重要です。
   2. サーモサイクル中の伸長温度よりT_m 10 - 15 °C高いブロッキングオリゴを設計します。ブロッキング塩基を_{追加または削除するか、}ブロッキングGまたはC塩基の長いストレッチ(3〜4塩基)を避けながらDNAをブロッキング塩基に置き換えることにより、TMを調整します。
      1. Oligoツールのウェブサイト(材料の表を参照)に移動し、「ブロッキングOligo Tm予測」ツールを選択します。
      2. ブロックしたいWTテンプレートの配列を「Oligo Sequence」ボックスに貼り付けます。ベースの前に「+」を追加して、ブロッカーベースを示します。
      3. 「Calculate」ボタンを選択して、DNA-BlockerハイブリッドのおおよそのTmを決定します。
   3. ブロッキングオリゴは、二次構造の形成や自己二量体の形成を避けるように設計します。
      1. Oligoツールのウェブサイト(材料の表を参照)に移動し、「ブロッキングOligo Optimizer」ツールを選択します。
      2. ブロックするWTテンプレートのシーケンスをボックスに貼り付けます。ベースの前に「+」を追加して、ブロッキングベースを示します。
      3. 「Secondary Structure」と「Self Only」の 2 つのボックスを選択します。Analyze(解析)ボタンを押して、オリゴに厄介な二次構造や自己二量体がないか確認します
         手記：スコアは、二次構造と自己二量_体のTmの非常に大まかな推定値を表しています。したがって、スコアが低いほど最適であり、ブロッカーとブロッカーのペアリングを制限することで達成できます。MYD88 [MYD88ブロッカー(TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/)]のブロッキングオリゴヌクレオチドは、アミノ酸Q262-I266をカバーするように設計されており、DNAポリメラーゼによる伸長と3'-エキソヌクレアーゼによる分解の両方を阻害する3'-逆dTを特徴としています。この特定のブロッキングオリゴは、「+N」で示される10のブロッキング塩基を持つ17量体です。残りの7塩基は通常のDNAヌクレオチドです。
3. WTB-PCRセットアップとサーモサイクリング
   1. 2.5 μL PCR 反応バッファー 10x w/ 20 mM MgCl₂、250 μM dNTP、0.2 μM フォワードおよびリバースプライマー、1.2 μM MYD88 ブロッカー、DNAse、RNAse フリー、超高純度 H₂O を使用して WTB-PCR マスターミックス (MMX) を調製し、反応あたり 21.75 μL の最終溶液量を作成します
      手記：使用濃度は、最終反応容量25 μL(DNAテンプレートとポリメラーゼの添加後)です。従来のPCR MMXは、ブロッカーの添加を省略するだけで調製されます。すべてのプロトコルステップは、WTBと従来のPCRの両方で同じです。これは、ブロッカーの添加によって達成される濃縮度の検証と決定に使用できます。
      1. 調製するMMXの量を計算する際には、3つの追加反応(ポジティブコントロールとネガティブコントロール、および汚染をチェックするための非テンプレートコントロール)と、ピペッティングエラーに対する少なくとも1つの追加反応を考慮してください。
   2. ボルテックスMMXを徹底的に。MMXは、-80°Cで最大1年間保存できます。
   3. MMXに反応ごとに0.25 μL Taq DNAポリメラーゼを添加し、反転させて混合します。ポリメラーゼをMMXに添加したら、氷の上に置いておきます。
   4. 新しい96ウェルPCRプレートをコールドプレートに置き、ポリメラーゼを含むMMX22μLを各反応ウェルにピペットで移します。
   5. 3 μLのゲノムDNA(50 - 100 ng/μL)を、ポリメラーゼを含むMMXを含む各ウェルに加えます。
   6. プレートを密封し、溶液が各ウェルの底に到達するように短時間遠心分離します。
   7. PCRプレートをサーモサイクラーにロードします。
      1. WTB-PCR反応の熱サイクル条件を次のように設定します:初期変性を95°Cで6分間、40サイクルの変性を95°Cで30秒間、プライマーアニーリングを56°Cで30秒間、72°Cで1分間20秒間伸展させ、72°Cで10分間伸長します
         手記：ベストプラクティスは、将来のセットアップでアンプリコン汚染を避けるために、物理的に離れた領域でプロトコルの残りの部分を完了することです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mLまたは2 mLのSafe-Lockマイクロ遠心チューブ	エッペンドルフ	05-402-25
アルコール100%	VWRの	89370-084	組織学グレード;91.5%エタノール、5%イソプロピルアルコール、4.5%メチルアルコール
アルミシールホイル	ジーンメイト	T-2451-1	PCRおよび低温保存用
遠心分離機 5804 series	エッペンドルフ		A-2-DWPローター(PCRプレート用)
96ウェルプレート用コールドプレート	エッペンドルフ	Z606634
DNAse、RNAseフリー、超純水
dNTP(100 mM)	インビトゲン	10297-117
エタノールアブソリュート	シグマ	E7023	200プルーフ、分子生物学用
Exiqon ウェブサイト Oligo Tools			http://www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNAポリメラーゼ(5 U/μL)	ロシュ	12032937001	10倍濃縮PCR反応バッファー、20 mM MgCl2
ゲル電気泳動装置			2% アガロースゲル
LNAオリゴヌクレオチド	エクシコン	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A +T+CC/invdT/ (+N = LNA塩基)
マスターサイクラープロSサーモサイクラー	エッペンドルフ	E950030020
マイクロ遠心分離機モデル5430	エッペンドルフ		FA-45-30-11ローター(1.5/2mL微量遠心チューブ用)
NanoDrop 2000 分光光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック
PCRフォワードプライマー	IDTの		5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCRリバースプライマー	IDTの		5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCRプレート	ジーンメイト	T-3107-1
ピペッター			20、200、1,000 μL
QIAamp DNAミニキット	キアゲン	51304	BM吸引液および末梢血用
ボルテックスジーニー	科学産業	SI-0236
スライドバスケット