バクテリオファージを列挙するための定量的ポリメラーゼ連鎖反応

要約

出典: Peng, X., et al., Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning. J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオでは、DNA定量によってT7バクテリオファージを列挙するための定量的ポリメラーゼ連鎖反応、qPCRについて説明します。PCR混合物中の蛍光色素は、新たに合成されたDNA鎖と結合して蛍光を発し、これを測定します。

プロトコル

1. qPCR反応の準備

>注:1つのPCR反応は1つのサンプルに対してです。各PCR反応液には、5 μLのqPCRマスターミックス(材料を参照)、1 μLの5 μMプライマーペアミックス、2 μLのH₂O、および2 μLの加熱処理T7ファージサンプルが含まれています。複数のPCR反応の場合、ファージサンプルを除くすべての試薬を1本の1.5 mLチューブにあらかじめ混合します。プレミックス中の各試薬の容量は、qPCR用のファージサンプルの数によって異なります。

1. 濃度が不明な 10 個のバイオパンドファージサンプルと、三重の標準濃度の 7 個のサンプルの qPCR プレミックスを調製します。その結果、合計51のサンプルが存在するため、51のqPCR反応(つまり、サンプルごとに1つの反応)があります。51反応の場合、255 μLのqPCRマスターミックス(51x 5 μL)、51 μLのプライマー(51x 1 μL)、および102 μLのH₂O(51x 2 μL)のプレミックスを調製します< br /> 手記：PCRミックスを96ウェルqPCRプレートの各ウェルに分注する際の体積損失を補うために、いくつかの追加のPCR反応を準備することをお勧めします。
2. 8 μL の PCR プレミックスを 96 ウェル qPCR プレートの各ウェルに分注して、合計 51 ウェル (すなわち、51 qPCR 反応) にします。分注時にチップを交換する必要はありません。
3. 加熱処理したT7ファージサンプル2 μLまたはT7ファージ参照DNAを各ウェルに添加します(図1B)。ウェルに異なるDNAサンプルを添加する際は、クロスコンタミネーションを防ぐためにチップを交換してください。また、2 μL の DNA サンプルを qPCR プレミックスの表面の下 (つまり、8 μL PCR プレミックス) に分注します。
4. qPCRプレートを粘着フィルムで密封します.
   手記： このステップは、qPCRプレートの種類に関係なく重要です。推奨キットを使用して、プレートを完全に密封します。そうしないと、プレート内の密閉されていない領域がPCRサイクリング中に体積損失を引き起こします。
5. 蛍光光退色を最小限に抑えるためにqPCRプレートをアルミホイルで包み、qPCR装置上での実行に進みます。

2. qPCRサイクリング条件

>注:qPCRサイクリング条件は、特定のqPCR装置で設定されました。

1. 96ウェルqPCRプレートをqPCR装置で泳動します。装置上で、メニューから設定を選択し、以下の実験条件を設定します(図1C)。
2. サンプル量が 10 μL の場合、50°C で 1 サイクルで 2 分間、95°C で 1 サイクル 2 分間、続いて 40 サイクル (95°C で 15 秒、60°C で 1 分間) のサイクル条件を次のように設定します。その後、メルトカーブの設定(95°Cで15秒、60°Cで1分間、95°Cで15秒)を1サイクル実行します。
3. データの分析に進みます。

結果

図1:ファージサンプルの処理、qPCR反応の準備、およびqPCRの実行。前処理した DNase I T7 ファージサンプルを 100°C で 15 分間加熱して、無傷のファージ粒子 (A) から T7 DNA を遊離させました。qPCR混合物は、プロトコルに記載されているように調製した。すべての準備は氷の上で行われました(A)。qPCR装置と互換性のあるソフトウェア(B)を使用して、サイクリング条件の設定、PCRサイクルの実行、生データの取得、および分析を行いました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
T7ゲノムDNAのプライマー	IDTの		F:CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R:TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT
T7 セレクトパッケージングコントロール DNA	EMDミリポア	69679から1UG
MicroAmp光学96ウェル反応プレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック	N8010560
qPCR マスターミックス-パワーアップ SYBR グリーンマスターミックス	応用バイオシステム	応用バイオシステム
MicroAmp光学接着フィルムキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	サーモフィッシャーサイエンティフィック
UltraPure DNase/RNase-Free 蒸留 H2O	インビトゲン	10977015
ViiA7 リアルタイム PCR システム、高速 96 ウェルブロック	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4453535
QuantStudio リアルタイム PCR ソフトウェア	サーモフィッシャーサイエンティフィック		v1.2

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