$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ssDNA増幅のための非対称PCR
- 解析対象のssDNAを増幅するための非対称PCR試薬ミックスを調製します。表1の試薬を氷上で解凍します。Taqポリメラーゼ酵素(50 U/μL)を氷上に保管せず、必要になるまで20°Cで保存してください。
- すべての試薬を穏やかにボルテックスし、チューブを10,000 x gで10秒間短時間遠心分離します。
- 表1に記載されているように、すべての試薬を組み合わせます。
- サンプルをサーモサイクラーに入れ、25サイクル(95°Cで30秒、52°Cで30秒、72°Cで30秒)、85°Cで5分間、4°Cで保持する条件下で非対称PCRを開始します。
2. ssDNAを増幅するためのマイクロスフェアPCR
>注:このセクションでは、PCR反応チューブでssDNAを増幅するためのプロトコルについて説明します。マイクロスフェア-PCR反応は、50μLの反応容量で行いました。ssDNAの増幅に使用される詳細な配列を表2に示します。この場合、ミクロスフェアの表面上のApは、相補的な方法でランダムなDNAテンプレートにアニールできます。これは、相補的なDNA鎖を作製するための非常に重要なステップです(アンチセンスDNA鎖、図1)。伸長したDNAは、マイクロスフェアPCR増幅のテンプレートとして使用されます。
- microsphere-PCR試薬ミックスを調製します。表3の試薬を氷上で解凍します。ただし、Taqポリメラーゼ酵素を氷上に保管しないでください。必要になるまで-20°Cで保管してください。
- すべての試薬を穏やかにボルテックスし、チューブを10,000 x gで10秒間短時間遠心分離します。
- 顕微鏡計数により約~25個のミクロスフェアを得る
手記：1つの反応チューブ内のマイクロスフェアの数は、40倍の倍率の光学顕微鏡を使用して計算されます。約~25個のマイクロスフェアがマイクロスフェアPCR増幅に使用されます。詳細については、ステップ 3 を参照してください。
- 表3に記載されているように、すべての試薬を組み合わせます。
- サンプルをサーモサイクラーに入れ、25サイクル(95°Cで30秒、52°Cで30秒、72°Cで30秒)、85°Cで5分間、4°Cで保持する条件下で非対称PCRを開始します。
- 増幅後、8 μL の 6x ローディングバッファーを加え、各サンプルの 15 μL を 2% アガロースゲルにロードします。次に、1x TAE(トリス-アセテート-EDTA、40 mM トリス-アセテート、1 mM EDTA、pH 8.2)バッファーで100 Vで35分間電気泳動を行います。
>表 1.非対称PCR試薬は、20μLの反応で成分を混合します。
%
名
| 試薬 | 1x反応容量(μL) | 最終濃度 |
| ランダムDNAテンプレート | 1 | 1 ng/μL |
| タグフォワードプライマー | 1 | 0.4 μM |
| リバースプライマー | 1 | 0.02 μM |
| 10X Taqバッファ | 5 | 1倍 |
| 10 mM の dNTP | 4 | 2.5 mM |
| Ex taq(1000U) | 0.2 | 1 ユー |
| 水 | 37.8 | - |
| トータル | 50 | - |
>表 2.Microsphere-PCRの配列情報。
名
名
名
| テンプレート | 順序 | 長さ (nt) |
| ランダムDNAテンプレート | 5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (ランダムシーケンス、40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| タグフォワードプライマー(Tag-F) | 5'- GGT AAT ACG ACT、CAC、TAT、AGG、GAG、ATA、CCA、GCT、TAT、TCA、ATT-3' | 42 |
| リバースプライマー | 5フィート - AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
>表 3.Microsphere-PCR 試薬は、50 μL の反応で成分を混合
します
%
名
| 試薬 | 1x反応容量(μL) | 最終濃度 |
| APマイクロスフェア | ~25 個のマイクロスフェア | - |
| ランダムDNAテンプレート | 1 | 1 ng/μL |
| タグフォワードプライマー | 1 | 0.4 μM |
| 10X Taqバッファ | 5 | 1倍 |
| 10 mM dNTP | 4 | 2.5 mM |
| Ex taq(1000U) | 0.2 | 1 ユー |
| 水 | 37.8 | - |
| トータル | 50 | - |
