特定のウイルスゲノム配列を検出するためのネストPCR

要約

出典:Feng, Y., et al.リッサウイルスの検出のためのユニバーサルネステッド逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の評価。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、2つのプライマーセットを使用した2つの連続的なPCR増幅プロセスで構成される手法であるネストポリメラーゼ連鎖反応について説明しています。プライマーの第1のセットは、第2のセットの上流の配列にアニーリングすることを意図しており、その結果、特定の遺伝子配列の選択的増幅がもたらされます。このPCRは、通常のPCRよりも感度と特異性が高く、さまざまな疾患の検出技術として広く使用されています。

プロトコル

1. ウイルスRNAの逆転写

1. 表1に記載されているRT試薬を冷凍庫から取り出し、氷上に保管し、解凍して渦巻き状にしてから使用してください。
2. 0.2 mL PCRチューブに12 μLのRT反応ミックスを、表1に示す試薬と共に調製します。必要以上に1つの反応サイズ以上のマスターミックスの量を調製することにより、ピペッティングのバリエーションを可能にします。
3. 8 μLのサンプル、ポジティブコントロールRNA、またはネガティブコントロールを、テンプレートルームのPCRワークステーション内のRT反応ミックスに加えます。RTポジティブコントロールは、固定RABV株CVS-11(チャレンジウイルススタンダード-11)に感染した細胞培養物から抽出したRNAで、-80°Cで保存します。ネガティブコントロールには、RNaseフリーの_ddH2Oが含まれています。
4. RTチューブの内容物を頂点で混合し、その後、短時間遠心分離します。
5. 反応チューブをサーマルサイクラーにロードします。次の条件でcDNA合成プログラムを設定します:42°Cで90分間、95°Cで5分間、4°Cを保留にします。反応量を20 μLに設定し、RTランを開始します。

2. ファーストラウンドPCR

1. 表2に記載されているPCR試薬は、使用までクリーンルームの氷上に置いておき、その後、解凍してボルテックスします。
2. 1回目のPCRミックスを0.2 mL PCRチューブで調製し、表2に記載されている試薬を添加します。
3. cDNAまたはプラスミドの2 μLサンプルを、テンプレートルームのPCRワークステーション内のファーストラウンドPCRミックスに加えます。PCR陽性コントロールは、上記のRT法のステップ1.3で述べたように調製したCVS-11 cDNAである。PCR陰性コントロールは_ddH2Oです。
4. 密封されたチューブをPCRサーマルサイクラーに移し、表3にリストされているパラメータを使用してサイクルします。

3. 2回目のPCR

1. 表4に記載されている試薬を使用して、0.2 mL PCRチューブで2回目のPCRミックスを調製します。
2. 第1ラウンドPCR産物2 μLを第2ラウンドPCRミックスに加えます。さらに、第2ラウンドPCRの陰性制御として_ddH2Oを含めます。
3. ステップ2.4で示したのと同じパラメータを使用してPCRサーマルサイクリングを実行します。

表1:cDNA合成のための逆転写試薬。

名

コンポーネント	反応あたりの容量 (μl)
dNTPs (2.5 mM )	4
ランダムプライマー (50 μM)	1.5
オリゴ(dT) 15 (50 μM)	0.5
M-MLVバッファ(5倍)	4
M-MLV逆転写酵素(200 IU/μL)	1
RNasin(40 IU/μL)	1
総ボリューム	12

表2:第1ラウンドPCRの試薬。

% 名

コンポーネント	反応あたりの容量 (μl)
dNTP(10 mM)	1
Ex-Taq(5 U/μL)	0.3
Taqバッファ(10倍)	5
N127 (20 μM)	1
N829 (20 μM)	1
dd H2O	39.7
総ボリューム	48

表3:1回目および2回目のPCRのサイクリングパラメータ

名 名 名

温度	時間	サイクル
94°C	2分間	1
94°C	30秒	35
56°C	30秒	35
72°C	40秒	35
72°C	10分間	1
4 °C	∞

表4:第2ラウンドPCRの試薬。

% 名

コンポーネント	反応あたりの容量 (μl)
dNTP(10 mM)	1
Ex-Taq(5 U/μL)	0.3
Taqバッファ(10倍)	5
N371F(20μM)	1
N371R (20 μM)	1
dd H2O	39.7
総ボリューム	48

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ddHの2O	諸	諸
dNTP(10 mM)	タカラ	4019
dNTPs(2.5 mM)	タカラ	4030
Ex-Taq(5 U/μL)	タカラ	RR001
マイクロ遠心チューブ	諸	諸
M-MLV逆転写酵素(200 IU/μL)	タカラ	2641Aさん
オリゴ(dT)15	タカラ	3805
PCRマシン	バイオラッド	T100
PCRチューブ	諸	諸
ピペッター	諸	諸
ランダムプライマー	タカラ	3801
RNase阻害剤(40 IU/μL)	タカラ	2313Aの
RNaseフリーddH2O	タカラ	9102
Taqバッファ(10倍)	タカラ	9152Aの
ヒント	諸	諸
ボルテックスミキサー	諸	諸