方法論記事

変異型DNA配列の配列変動を決定するための高分解能メルティングPCR

2025年7月8日

この記事について

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出典:Kisserli, A., et al.補体受容体1長多型ジェノタイピングのための高分解能融解PCR:アルツハイマー病遺伝子感受性評価のための革新的なツール。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオでは、融解温度分析に基づいて、さまざまな配列長のDNA断片の長さ多型を決定するための高分解能融解PCR技術について説明します。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HRM-PCRプロトコル

  1. DNAサンプルを解凍します。DNAサンプルを1.5 mLチューブで水で希釈し、10 ng/μL
    の濃度に調整します。 手記：希釈したDNAの総量は2μLから10μLの間である必要があります。
  2. プライマー溶液を解凍します。プライマー溶液を1.5 mLチューブで水で希釈し、同じ濃度の6 μM.
    に調整します。 手記：プライマー配列および反応条件を表1に示す。
  3. HRM-PCRキット溶液を解凍し、ボルテックスで慎重に混合して、すべての内容物が確実に回収されるようにします。DNA結合色素、MgCl2、および水を含む酵素混合物を含む3つのバイアルをマイクロ遠心分離機で簡単に回転させてから、開きます。室温で保存してください。
  4. 室温の1.5 mLチューブに、以下の成分を以下の順序で添加して、20 μLの反応1回分のPCRミックスを調製します。
    1. 10 μLの酵素混合物とDNA結合色素;
    2. 2 μL の 25 mM MgCl2;
    3. プライマー1、6μM(最終濃度:300nM)の1μL。
    4. プライマー 2、6 μM (最終濃度: 300 nM) 1 μL
    5. 5 μL の水.
      手記： PCRミックスを複数の反応用に調製するには、上記の容量に、実行する反応の数と1つの追加反応を掛けます。
  5. ボルテックスで慎重に混ぜます。
  6. 上記で調製したPCRミックス19μLを、白色マルチウェルプレートの各ウェルにピペットで
    7. 挿入します。
  7. 濃度調整DNAテンプレート1 μLを添加
    手記：コントロール反応の場合は、常にサンプルでネガティブコントロールを実行します。ネガティブコントロールを調製するには、テンプレートDNAを水で置き換えます。
  8. 白いマルチウェルプレートをシーリングホイルでシールします。
  9. 白色のマルチウェルプレートを遠心分離機に置き、適切なカウンターウェイト(つまり、別のマルチウェルプレート)とバランスを取ります。1,500 x gで1分間遠心分離し、マルチウェルプレート用のローターと適切なアダプターを備えた標準的なスイングバケット遠心分離機で行います。
  10. 白色のマルチウェルプレートをHRM-PCR装置にロードします。
  11. 次のPCR条件でHRM-PCRプログラムを開始します:
    変性:95°Cで10分間;1サイクル.
    増幅:95°Cで10秒、62°Cで15秒、72°Cで20秒。47 サイクル.
    融解曲線:95°C;ランプレート:0.02°C/s;°Cあたり25回の買収。1サイクル.
    冷却:40°Cで30秒。ランプレート2.2°C / s;1サイクル。

figure-protocol-1

>表1:高分解能融解分析で使用されるプライマーとパラメータ。

2. CR1長多型を決定するためのHRM解析

>注:説明されている方法論(図1)は、他のソフトウェアパッケージを使用することもできますが、当社のソフトウェア(資料の表を参照)に固有のものです。

  1. 遺伝子スキャンソフトウェアを開き、CR1長多型スキャン解析を実行します。
  2. 増幅プログラムと融解曲線プログラムを含む実験を開きます。
  3. モジュールバーの「サンプルエディター」をクリックし、スキャンワークフローを選択します。
  4. サンプルのプロパティ(名前、不明またはネガティブコントロール)を定義します。
  5. モジュールバーの「分析」をクリックします。
  6. 「新規解析の作成」リストで、「遺伝子スキャン」を選択します。
  7. Normalizationタブをクリックして、融解曲線を正規化します。
  8. [温度シフト]タブをクリックして、融解曲線の温度軸(x軸)をリセットします。
    手記： 下のグラフは、正規化された融解曲線と温度シフトされた融解曲線を示しています。
  9. [計算] ボタンをクリックして、結果を分析し、グループ化を決定します。
  10. チャート領域の差分プロットタブをクリックして、正規化融解曲線とシフト融解曲線、正規化融解曲線と温度シフト差プロットを表示します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
図1:プロトコルのステップ2で使用したソフトウェアのグラフィカルインターフェイスのスクリーンショット。(A)遺伝子スキャンソフトウェアを開きます。 (B)増幅プログラムと融解曲線プログラム。 (C) モジュールバーの「サンプルエディター」をクリックします。 (D)スキャンを選択します。 (E) サンプルのプロパティを定義します。 (F) モジュールバーの「Analysis」をクリックします。 (G) Normalizationタブをクリックして、融解曲線を正規化します。 (...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
白衣保護
SensiCareIceパウダーフリーニトリル検査用手袋Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060 アメリカ合衆国486802サンプル保護
Eppendorf Reference 2ピペット、0.5-10μLEppendorf France SAS、F-78360 Montesson、フランス4920000024サンプルピペッティング
Eppendorf Reference 2ピペット、20-100μLEppendorf France SAS、F-78360 Montesson、フランス4920000059サンプルピペッティング
Eppendorf Reference 2ピペット、100-1000μLEppendorf France SAS、F-78360 Montesson、フランス4920000083サンプルピペッティング
TipOne 10μL 目盛り付き、フィルターチップStarlab GmbH, D-22926 アーレンブルク, ドイツS1121-3810サンプルピペッティング
TipOne 1-100μL面取り、フィルターチップ Starlab GmbH, D-22926 アーレンブルク, ドイツS1120-1840サンプルピペッティング
ART 1000E バリアチップThermo Fischer Scientific、F-67403 Illkirch、フランス2079Eサンプルピペッティング
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, エッペンドルフクオリティEppendorf France SAS、F-78360 Montesson、フランス30120086混ぜる
ボルテックス-魔神2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA (米国ニューヨーク州ボヘミアSI-0236混ぜる
Mikro 200遠心分離機Hettich Zentrifugen、D-78532、ドイツ0002020-02-00遠心分離
マルチペットE3Eppendorf France SAS、F-78360 Montesson、フランス4987000010流通
Light Cycler 480 マルチウェルプレート 96、ホワイトRoche Diagnostics GmbH, D-68305 マンハイム, ドイツ4729692001反応場所
Light Cycler 480シーリングホイルRoche Diagnostics GmbH, D-68305 マンハイム, ドイツ4429757001カバレッジ
LightCycler 480 Instrument II, 96ウェルRoche Diagnostics GmbH, D-68305 マンハイム, ドイツ05015278001高分解能溶融ポリメラーゼ連鎖反応
ヘレウス Megafuge 11R 遠心分離機Thermo Fischer Scientific、F-67403 Illkirch、フランス75004412遠心分離
LightCycler 480 高解像度メルティングマスターRoche Diagnostics GmbH, D-68305 マンハイム, ドイツ04909631001反応試薬
CN3プライマー:5'ggccttagacttctcctgc 3'Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, Belgium (ユーロジェンテック・バイオロジクス・ディビジョン, B4102 Seraing, Belgium反応試薬
CN3re プライマー: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, Belgium (ユーロジェンテック・バイオロジクス・ディビジョン, B4102 Seraing, Belgium反応試薬
ライトサイクラー480 SW 1.5.1ソフトウェアRoche Diagnostics GmbH, D-68305 マンハイム, ドイツHRM-PCR CR1多型データ解析に用いるソフトウェア
) ) )

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タグ

DNA PCR DNA CR1

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