出典:Malic, L., et al.血液学的診断のためのポリマー液滴発生装置を用いたメチル化特異的マルチプレックス液滴PCR.J. Vis. Exp. (2020年)
このビデオは、臨床診断と予後の早期バイオマーカーとして、異なる白血球集団のメチル化DNA領域を同時に定量するためのマルチプレックス液滴ポリメラーゼ連鎖反応技術を示しています。
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方法論記事
白血球におけるDNAメチル化を検出するためのマルチプレックス液滴ポリメラーゼ連鎖反応
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
1. 液滴生成とPCR
注:表1は、フォワードプライマーとリバースプライマー、および脱メチル化遺伝子ターゲットのマルチプレックス増幅に必要なC-LESS、CD3Z、およびFoxp3遺伝子のダブルクエンチ加水分解プローブに関する情報を概説しています。
- 表2の説明に従ってマスターミックスを調製します。
- 酵素ミックスを除くマスターミックスのすべての成分を解凍します。マスターミックスをピペッティングで上下させて完全に混合し、短時間スピンダウンします。
- PCRチューブ内のマスターミックスに、適切な量(1 μL)のバイサルファイト変換DNAを添加します。ピペッティングでアップダウンし、短時間スピンダウンして反応を混合します。
- PEEKフィッティングを使用して、使い捨て流体チューブ(内径0.25 mm、外径1.6 mm)を2つの精密ガラスシリンジ(容量250 μL)に接続します。
- 精密ガラスシリンジ1本に、5%のフッ素系界面活性剤を含む250μLのキャリアオイルをプレフィルします。
- 別の精密ガラスシリンジに50 μLのキャリアオイルを充填してから、100 μLのPCRミックスをロードして、乳化中にサンプル量全体が分注されるようにします。
- ハイスピードカメラを搭載した正立光顕微鏡のステージ上に液滴マイクロ流体デバイスを設置し、液滴形成をリアルタイムに観察・記録します。
- プレフィルドシリンジをプログラム可能なシリンジポンプに置き、フィッティング付きのPEEKユニオン(材料の表を参照)を使用して、シリンジのチューブを液滴マイクロ流体デバイスのそれぞれの入口チャネルのチューブに接続します。
- 液滴発生器の出口からのチューブを0.5mL PCRチューブ内に入れます。
- シリンジポンプの流量を2μL / minに調整し、液滴サイズが安定するまで待ってから、得られたエマルジョンを収集します。
- エマルジョンを回収し、75 μLを0.2 mL PCRチューブに移してサーマルサイクリングします。
- サーマルサイクリング中の液滴の合体を防ぐために、PCRチューブ内の油分が分散相の体積と密接に一致することを確認してください。
- 0.2 mL PCR チューブをサーマルサイクラーに入れ、95 °C で 5 分間予熱し、次に 95 °C で 15 秒間 45 サイクルの変性を行い、60 °C で 30 秒間アニーリング/伸長するサイクリングプロトコルを実行します。
表1:プライマーおよび加水分解プローブの設計。
| FOXP3フォワード | GGG TTT TGT TGT TGT AGT TTT TG |
| FOXP3リバース | TTC TCT TCC TCC ATA ATA タカ |
| CD3Zフォワード | GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG |
| CD3Z リバース | CAA、AA、CTC、CTC、TTC、TCC、TAA、CCA |
| C-LESSフォワード | TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA |
| C-LESS リバース | TTT CTT CCA CCC CTC CTC TTC C |
| FOXP3プローブ | /56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/ |
| CDZ3プローブ | /56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/ |
| Cレスプローブ | /56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/ |
表2:mdPCRのマスターミックスレシピ。
| 試薬 | ストックソリューション | マスターミックスボリューム | 作業集中力 |
| トリス-HCl | 1メートル | 2 μL | 20 mM |
| KClの | 1メートル | 10 μL | 100 mM |
| MgCl2 | 25メートル | 16μL | 4メートル |
| C-LESSプライマー | 10 μM | 10 μL | 各1μM |
| CD3Zプライマー | 10 μM | 10 μL | 各1μM |
| FOXP3プライマー | 10 μM | 10 μL | 各1μM |
| C-LESSプローブ | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| CD3Zプローブ | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| FOXP3プローブ | 10 μM | 5 μL | 500 nM |
| HotStarTaq DNAポリメラーゼ | 5ユニット/μL | 8 μL | 0.4ユニット/μL |
| バイサルファイト処理DNAターゲット | 変数 | 変数 | 変数 |
| ヌクレアーゼフリーウォーター | 変数 | ||
| 総ボリューム | 100μL |
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| PCRチューブ | バイオ・ラッド、ミシサガ、オンタリオ州 | TFI0201 | |
| フッ素系界面活性剤 | RAN Biotechnologies、マサチューセッツ州ビバリー | 008-フッ素界面活性剤 | |
| 使い捨て流体チューブ | ドロマイト | 3200063 | |
| 使い捨て流体チューブ | ドロマイト | 3200302 | |
| PEEKフィッティング | IDEX Health & Science、ワシントン州オークハーバー | P-881 | |
| キャリアオイル | 3M、セントポール、ミネソタ州 | ||
| 正立光顕微鏡 | ニコン、メルビル、ニューヨーク |
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