Chip-in-a-TubeベースのデジタルPCRによる単一ヌクレオチドバリアントの定量

要約

出典:Kahyo, T., et al.Chip in-a-tube形式を使用した散発性家族性腺腫性ポリープ症患者の遺伝的変異のためのデジタルポリメラーゼ連鎖反応アッセイ。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、DNAサンプルの単一塩基変異を検出するためのチップインチューブ形式のデジタルPCRの有用性を示しています。1つのPCR反応を独立したPCR反応として作用するチャンバーに分割し、チャンバー内の増幅されたターゲットからの蛍光シグナルの検出を使用して、サンプル中のバリアント対立遺伝子の周波数を計算します。

プロトコル

1. ゲノムDNAの品質管理

>注:ゲノムDNA(gDNA)は、確立されたシリカ膜ベースのDNA精製法を使用して末梢血から抽出されました。以下の手順に先立って、gDNAの濃度を分光光度計を用いて決定しました。

1. gDNAサンプルを10-100 ng/μLの濃度で調製します。
2. 10 μLのDNAサンプルバッファーを8チューブストリップに加えます。
3. 1 μLのDNAラダーまたはgDNAをチューブに加えます。マイクロプレートアタッチメントを使用して混合物を1分間ボルテックスします。
4. チューブ、ゲルデバイス、ピペットチップを電気泳動装置(Table of Materials)にロードし、「Start」ボタンを押してランを開始します><。 手記：電気泳動システムは、スタートボタンを1回クリックするだけで自動的に動作します。
5. DNAサンプルバッファーに含まれる下部マーカーがエレクトロフェログラムに正しく割り当てられていることを確認します。誤って割り当てられている場合は、ソフトウェアの「エレクトロヘログラムモード」でマーカーを手動で割り当ててください.
   手記：DNA完全性数(DIN)は自動的に計算されます。DIN値はDNAの完全性に由来します。DIN値が高い場合と低い場合、それぞれ無傷のgDNAと強く分解されたgDNAを示します。
6. ソフトウェアの「リージョンモード」でgDNAのサイズ領域(> 200 bp)を指定すると、gDNA(> 200 bp)の濃度が自動的に計算されます。

2. プライマーとプローブの設計

1. 次の条件下で、任意のオープンアクセスツールを使用して融解温度(Tm)の値を計算します:10-25塩基、50 mM Na ⁺/K ⁺、0.80 mM dNTPs、および3 mM Mg²⁺(材料表)。T_m値が約60°C、アンプリコン長が100-300 bpの標的対立遺伝子を含むゲノム領域を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーを設計します
   注:オリゴヌクレオチドの濃度については、表1を参照してください。
2. 以下の条件に基づいて、参照対立遺伝子および変異対立遺伝子のロック核酸(LNA)プローブを設計します:(i)各プローブに1〜6個のLNAが存在します。(ii)蛍光色素およびクエンチャーが、各プローブの5'末端および3'末端にそれぞれ存在し、(iii)一致したプローブと一致したプローブと一致しないプローブ_のTm値の差が>10°Cである。(iv)マッチングプローブとミスマッチプローブ_のTm値は、それぞれプライマーの値よりも高く、低くなっています[例:フォワードプライマー:60.8°C、リバースプライマー:59.8°C、参照対立遺伝子プローブ(一致/不一致):62.6 / 45.3°C、バリアント対立遺伝子プローブ(一致/不一致):61.7 / 50.5°C]。T_m値は、ステップ2.1でも使用したオープンアクセスツールを使用して計算しました。
3. 設計されたプライマーおよびプローブが、データベース[例:一塩基多型データベース(dbSNP)]から決定される頻度>0.1%の一塩基多型を含んでいないことを確認してください。

3. デジタルPCR

1. 表 1 に記載の濃度のプライマー、プローブ、および gDNA ストック溶液を TE バッファーで調製し、-20–4 °C で保存します。
試薬
2. を室温で全容量15 μLに混合し、表1に示す最終濃度にします。
   1. gDNAの代わりに3 μLの蒸留水を加え、テンプレートなしコントロール(NTC)で調製します。
   2. ピペッティングエラーを考慮して、3.5倍の量のPCR混合物をトリプリケートで調製します。
3. PCR混合物を上下にピペットで動かして混合します。
4. ローディングプラットフォームを8チューブストリップに組み込まれたチップにセットし、オートローダーにセットします。チップとローディングプラットフォームとの間に接触があることを確認します。
5. ローディングスライダーをプラットフォームに取り付け、ストッパーをローダーから離してスライダーを保持します。
6. PCR混合物15 μLをスライダーの先端近くのプラットフォームにピペットで移します(図1A)。
7. ローダーのボタンを押してローダーを実行します(約1分間).
   手記：プラットフォーム上に少量のPCR混合物が残っていても問題ありません。ローダーを順次再実行することが可能です。
8. PCR混合物を充填したチップインチューブをシーリングエンハンサーのサイドスロットにセットします。スライドリッドと上蓋の端を押して、チップが壊れないようにします(図1B)。
9. シーリングエンハンサーを実行します(約2分)。不完全なシーリングが正の信号の相互汚染を引き起こすために液体の水たまりがまだ見える場合は、シーリングエンハンサーを1分間連続して再実行します(図1Cおよび1D)。
10. 230 μLのシーリングフルード、油性試薬をチューブに加えます.
    手記：これで、チップが液体に浸されます。
11. サーマルサイクラーにチューブをセットします。表 2 の説明に従ってサーマルサイクラーを実行します (約 2 時間)。正のパーティションが不均一な分布にある場合は、PCRの温度または時間を調整します(図1E).
    注意: rを設定することをお勧めしますampレートは約1°C / sに
。
12. ベースラインノイズを減らすために、チューブをサーマルサイクラーに少なくとも15分間放置します。
    手記：チューブは一晩置いておくこともできます。翌日でも蛍光シグナルが検出されました。
13. 検出治具にチューブをセットし、6mLの蒸留水を治具に注ぎます。チューブの内側と外側に気泡が見える場合は、気泡を取り除きます(図1Fおよび1G)。
14. ジグを検出器にロードし、Fluorescence、Experiment、Sample/NTCタブ(Table of Materials)を選択後、ソフトウェアの「Run」ボタンをクリックして実行します
    注:デフォルトの強度で8つのサンプルのデュアルカラー検出には、約4〜5分かかります。
15. 位置プロット、ヒストグラム、2D散布図を確認します.
    注:ネガティブパーティションの蛍光強度が高い場合は、ソフトウェアの[設定]ボタンをクリックして強度を調整し、30〜70の範囲に収ま
るようにします。
16. 次の式を使用して、バリアント対立遺伝子分率(VAF)を計算します:
    
    ここで、Cv と Cr は、それぞれバリアントと参照対立遺伝子のコピー番号です。
    手記：これらは、ポアソン統計に基づいてソフトウェアプログラムで自動的に計算されます。

4. PCR産物の回収

1. チューブからシーリング液を取り除きます。
2. 100 μL の TE バッファーをチューブに加えます。30秒間激しくボルテックスし、チューブを短時間遠心分離します。
3. TE溶液を別のチューブに移し、30 μLの3 M酢酸ナトリウムと200 μLのエタノールを加えます。
4. 溶液を-20°Cで一晩冷却します。
5. 溶液を16,000 x gで30分間遠心分離し、上清を除去します。
6. 300 μLの80%エタノールをチューブとボルテックスに加えます。
7. 溶液を16,000 x gで15分間遠心分離し、上清を除去します。沈殿物を5分間風乾させます。
8. 自然乾燥後、沈殿物を 1–5 μL の TE バッファーに溶解します。
9. 必要に応じて、ステップ1を参照して電気泳動装置を使用して製品サイズを評価します。1 μLの溶液をゲルデバイスにロードして、高感度にします(材料表)。

結果

図1:チップイン・ア・チューブ形式のdPCRアッセイの留意点。(A) このパネルは、オートローダーの 8 チューブ ストリップの設定方法を示しています。(B)このパネルは壊れたチップを示しています。(C)このパネルは、(i)ローディングと(ii)シーリングの直後のチップの表面を示しています。(iii)不完全なシーリングの場合、液体の水たまりが見えます。(D)このパネルは、クロスコンタミネーションの場合の位置プロットを示しています。(E) このパネルは、不均一な分布の場合の位置プロットを示しています。(F)このパネルは、チューブ表面の気泡が水に浸される様子を示しています。(G

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
QIAamp DNA 血液マキシキット	キアゲン	51194	プロトコル1の前:ゲノムDNAの抽出
ナノドロップ1000	サーモフィッシャー サイエンティフィック	ND-8000	プロトコル1の前:分光光度計
8ストリップチューブ	アジレント・テクノロジーズ	401428	プロトコル1
ゲノムDNAサンプルバッファー	アジレント・テクノロジーズ	〒5067-5366	プロトコル1:
			Genomic DNA Screen Tape Assayの成分
DNAラダー	アジレント・テクノロジーズ	〒5067-5366	プロトコル1:
			Genomic DNA Screen Tape Assayの成分
MS3ベーシックスモールシェーカー	イカ	3617000	プロトコル1:ボルテックスミキサー
ゲノムDNAスクリーンテープ	アジレント・テクノロジーズ	〒5067-5365	プロトコル1:ゲルデバイス
2200 TapeStation システム	アジレント・テクノロジーズ	G2965AA	プロトコル1:電気泳動装置
TapeStation解析ソフトウェア	アジレント・テクノロジーズ	G2965AAにバンドルされています	プロトコル1:解析ソフトウェア
DNAオリゴプライマー	IDTの	カスタムオーダー	プロトコル2
LNAプローブ	IDTの	カスタムオーダー	プロトコル2
ソフトウェアツール	IDTの	ウェブサイト: http://biophysics.idtdna.com/	プロトコル2
dbSNP データベース	NCBI	ウェブサイト: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/	プロトコル2
TEバッファ	サーモフィッシャー サイエンティフィック	12090015	プロトコル3
DNase/RNaseフリー蒸留水	サーモフィッシャー サイエンティフィック	10977015	プロトコル 3 (表 1)
クラリティデジタルPCRプローブマスターミックス	JNメドシス	12013	プロトコル 3 (表 1): 2xPCR マスターミックス
			#10011のコンポーネント
クラリティシーリングフルード	JNメドシス	12005	プロトコル3:シーリング液
			#10011のコンポーネント
クラリティ JN ソリューション	JNメドシス	12006	プロトコル 3 (表 1): 20xdPCR 溶液
			#10011のコンポーネント
クラリティチューブストリップ	JNメドシス	12007	プロトコル3:チップイン・ア・チューブ
			#10011のコンポーネント
クラリティサンプルローディングキット	JNメドシス	12008	プロトコル3:ローディングプラットフォームとスライダー
			#10011のコンポーネント
クラリティオートローダー	JNメドシス	11002	プロトコル 3: オートローダー
			#10001のコンポーネント
クラリティシーリングエンハンサー	JNメドシス	11003	プロトコル3:シーリングエンハンサー
			#10001のコンポーネント
クラリティリーダー	JNメドシス	11004	プロトコル3:リーダー
			#10001のコンポーネント
ライフエコサーマルサイクラー	Bioerの技術	TC-96GHbCの	プロトコル3:サーマルサイクラー
クラリティソフトウェア	JNメドシス	#10001にバンドル	プロトコル3:解析ソフトウェア
高感度D1000スクリーンテープ	アジレント・テクノロジーズ	〒5067-5584	プロトコル4:高感度のためのゲルデバイス