ナノ流体チップを使用して希少な転写産物バリアントを検出するためのチップベースのデジタルPCR

Abstract

出典:Molinari, C., et al.チップベースのデジタルPCRによる新鮮凍結胃癌組織におけるCDH1希少転写産物変異体の検出。 J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、チップベースのデジタルPCRを示しています。これは、希少な転写産物のバリアントを検出するのに役立つデジタルPCR技術のバリエーションです。PCR反応はナノ流体チップのチャンバーに分割され、それぞれが独立した反応として機能します。増幅されたターゲットを持つチャンバーからの蛍光シグナルの検出により、サンプル中にまれな転写産物バリアントが存在することが確認されます。

Protocol

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

>注:この手順は、ヒトの新鮮凍結組織中の少数のcDNA分子を検出するために特別に設計されています。組織切片は、以前に検証された患者由来の胃腫瘍または正常組織サンプルから、凍結したままドライアイスで切断されています。

1. RNAの単離と精製

1. RNA抽出
   手記：RNA単離は、特定の製品を使用して内部で行われます(材料の表を参照)。ただし、さまざまなアイソレーションキットが市販されています。
   1. 細かくカットした新鮮凍結組織サンプル50 - 100 mgを1.5 mLチューブに入れ、1 mLのRNA単離試薬と15秒間激しくボルテックスしてホモジナイズします。チューブを-80°Cで一晩インキュベー
   トします。
   2. サンプルを含むチューブを室温で5分間インキュベートし、15秒間ボルテックスして混合します。
   3. チューブを氷上に置き、200 μLのクロロホルムを加え、15秒間激しくボルテックスします。
   4. チューブを室温で60秒間インキュベートし、12,000 x gで4°Cで15分間遠心分離します。
   5. 水相を1.5 mLチューブに移し、20 μgのグリコーゲンを加えます
      手記：汚染を減らすために、相間層または有機層の移動を慎重に避けることが重要です。
   6. 500 μLのイソプロパノールを加え、チューブを反転させて混合し、氷上で10分間インキュベートします。
   7. チューブを12,000 x gで4°Cで15分間遠心分離し、RNA.
      を沈殿させます。 手記：RNAは、チューブの側面と底面にゲル状のペレットとして存在し、遠心分離後は見えなくなることがよくあります。
   8. 沈殿物を乱さずに上清を取り除き、ピペッティングにより75%エタノール1mLで洗浄します。
   9. チューブを7,500 x gで4°Cで5分間遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を除去します。
   10. 沈殿物が透明になるまでペレットを乾燥させ、50 μLのRNaseフリー水に溶解します。
   11. 定量前に、サンプルを-80°Cで少なくとも一晩凍結します。
2. ゲノムDNAの除去とRNA精製
   手記：DNase消化ステップとそれに続くカラムベースのRNA精製は、汚染DNAを消化するための少量のターゲットの分析に推奨されます。
   1. 凍結乾燥したDNase I(1,500Kunitz単位)を550μLのRNaseフリー水にシリンジで溶解し、バイアルを反転させて穏やかに混合し、再構成した原液をアリコートに分割します。
   2. 1.5 mLのチューブで、サンプルの計算容量を15 μgのRNA、キットのDNase Digestionバッファー10 μL(材料表に記載)、2.5 μLのDNase Iストック溶液、およびRNaseフリー水を加えて100 μLに移します。
   3. 350 μLの組織溶解バッファー(キットから、材料表を参照)を加え、ピペッティングで混合します。
   4. 100%エタノール250μLを加え、ピペッティングで混合します。
   5. 全容量(700 μL)を新しいスピンカラムに移し、12,000 x gで15秒間遠心分離します。
   6. フィルターを新しいコレクションチューブに移し、500 μL の 80% エタノールをカラムに加え、12,000 x g で 2 分間遠心分離します。
   7. スピンカラムの蓋を開け、新しいコレクションチューブで12,000 x gで5分間遠心分離してフィルターを乾燥させ、フィルターを1.5 mLチューブに移します。
   8. 14 μL の RNase フリー水を直接フィルターカラムに加え、12,000 x g で 1 分間遠心分離します。
   9. サンプルを氷上に保持し、ベンチトップ分光光度計で2 μLのサンプルを使用して定量に進むか、使用するまでRNAを-80°Cで保存します。

2. デジタルPCR反応のセットアップ

1. dPCR反応ミックスとサンプル調製
   1. マスターミックスとアッセイを室温で少なくとも20分間解凍します。
   2. cDNAサンプルを6 μLの水で300 ngの濃度に希釈します。
   3. マスターミックスを穏やかにボルテックスし、8.7 μLのマスターミックス、0.87 μLのCDH1aカスタム設計アッセイプライマー、および1.83 μLのヌクレアーゼフリー水を含む滅菌チューブでミックスを調製し、最終容量11.4 μL.
      手記：CDH1aカスタムデザインのアッセイプライマーの詳細については、材料表を参照してください。
   4. 調製した混合物11.4μLを希釈したcDNAサンプルに移し、穏やかに混合し、短時間遠心分離します
      手記： 容量には、ピペッティングによる容量損失を補うために20%の超過分が含まれています。すべてのサンプルのミックスとテンプレートなしコントロール(NTC)を準備します。
2. チップ調製
   注意: 最適な結果を得るには、できるだけ早くチップをロードしてください。
   1. チップローダーを接続し、インジケーターライトが緑色に変わるまで待ちます。
   2. プランジャーを1〜2 mmゆっくりと引き戻し、このステップを容易にするために解放することにより、浸漬液シリンジのキャップを取り外し、チップと交換します。.
   3. 新しいチップを取り、蓋に書かれているコードをメモして、サンプルに関連付けます。
   4. フタをしっかりと横に持ち、保護フィルムをはがし、粘着面を上にしてフタを正しい向きに置きます。
   5. 内部部分に触れないように注意しながら慎重にチップを拾い上げ、レバーを押し下げてクランプを開き、正しい位置でチップネストにロードします。
   6. 新しいローディングブレードをローダーにロードし、軽く押してしっかりと固定されていることを確認します。
   7. 14.5 μLのdPCR反応ミックスを、気泡を発生させたりブレードを偏向させたりせずにローディングブレードに移し、その後、黒色のローディングボタンを押してチップ上の容量を分散させます。
   8. 液浸シリンジを使用して、先端が表面に触れないように注意しながら、約20滴をチップ表面に移します.
      手記：端に液体をこぼさないように、表面全体を覆うことが重要です。
   9. ローダーアームを回転させて蓋をチップに接触させ、15秒間押し下げます。
   10. 蓋のボタンを押してチップを解放し、アームを元の位置に戻します。
   11. 組み立てたチップを45°の角度で保持し、シリンジで浸漬液を充填ポートから慎重に分注し、チップを少し回転させて気泡がないことを確認し、滅菌ワイプで余分な液体を取り除きます。
   12. チップカバー上部のラベルをそっと剥がしてチップケースを密封し、充填ポートを5秒以上押します。
   13. サーマルサイクラーにロードする準備ができるまで、チップを暗闇に保管します。
       手記：調製したチップは2時間以内に使用する必要があります。
3. dPCR反応
   1. 蓋を開けて、アダプターを両方のブロックに取り付けます(1つのブロックを使用する場合でも)。
   2. チップをsに置きますampファイルブロックの正しい位置に.
      手記： 充填ポートは、チップの窓を乱すことなく気泡が上部に浮かぶことができるように、高い位置でサーマルサイクラーの前面に向ける必要があります。空のチップを使用して、2つのブロックのバランスを取ります。
   3. サーマルパッドをサンプルブロックに置き、チップを完全に覆います。
   4. 蓋を閉め、次の条件を適用してPCRランを開始します:96°Cで10分間保持、60°Cで2分間、98°Cで30秒間のサイクルを45サイクル、60°Cで2分間保持、4°Cで保持します。サーマルサイクラーをオフにし、チップを室温で少なくとも10分間解凍します。
      手記：チップ分析は1時間以内に実行する必要があります。
4. チップ分析
   1. 機器の蓋を開けてサーマルパッドを取り外し、次にアダプターからチップを取り外します。
      手記：分析まで、チップは暗くてきれいな場所に保管してください。
   2. イソプロパノールと滅菌ワイプでチップ表面を清掃します.
      手記：各チップに漏れや潜在的な問題がないか検査します。
   3. USBを検出器システムに挿入して、データを保存します。
   4. 検出器システムのチップトレイを開き、チップを表向きにして正しい位置にセットしてから、トレイを閉じます。
   5. 処理のために30秒待ってから、チップを取り外して次のチップを挿入します。
   6. 処理されたすべてのチップの解析が完了するのを待ってから、USBをコンピューターに挿入してファイルを転送します。
      手記：解析の合計時間は約2〜3分/チップです。

3. データの解析と解釈

1. すべてのダウンストリーム解析を実行するために必要なクラウドベースのソフトウェアプラットフォームに接続します。
2. プロジェクトを作成し、対象のチップのすべてのデータファイルをインポートします。
3. サンプル名を入力し、「Define Chips」タブで使用した色素とアッセイを選択します。
4. 「Review Data」タブでチップを視覚化し、サンプルがチップにどの程度完全にロードされたか、評価可能なデータポイントの数を確認して、チップが許容できるかどうかを判断します。
   手記： 評価可能なデータポイントが13,000未満のチップを拒否します。
5. 画面の右側にある選択したチップの散布図に移動し、フルオレセイン アミダイト (FAM) レポーター色素のシグナル (Y 軸) のしきい値を 6,000 ですべてのチップに適用します。
   手記：閾値の設定は、使用するアッセイによって異なる場合があります。
6. 疑わしい陽性信号を削除して誤検出の結果を防ぐには、なげなわツールを使用して散布図上の相対スポットを選択し、[未確定]を押します。残りのすべての陽性スポットは、分析された希少なターゲットのcDNAコピーの存在を示しています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
トリアゾール試薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15596018
グリコーゲン 20 mg/ml	ロシュ	10901393001
RNeasy MinElute クリーンアップキット	キアゲン	74204
iScript cDNA合成キット	バイオラッド	1708891
QuantStudio 3DデジタルPCRマスターミックスv2	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A26358 の
CDH1a IDTカスタムデザインアッセイ	統合DNAテクノロジー(IDT)	NAの	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR最適化アッセイ濃度:900 nM (F)、900 nM (R)、250 nM (P)]
QuantStudio 3D デジタル PCR 20K チップキット v2	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A26316 (英語)
ヘレウス・バイオフージ・フレスコ	サーモサイエンティフィック	75002402
サーモサイクラー(Labcycler)	センソクエスト	011-103
GeneAmp PCRシステム 9700	サーモフィッシャーサイエンティフィック	N805-0200
デュアルフラットブロックサンプルモジュール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4425757
QuantStudio 3D チルトベース、デュアルフラットブロック GeneAmp PCR システム 9700	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4486414
フラットブロックサーマルサイクラー用QuantStudio 3DデジタルPCRチップアダプターキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4485513
QuantStudio 3DデジタルPCRチップローダー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4482592
QuantStudio 3DデジタルPCR装置(電源コード付き	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4489084