ナノ流体チップを使用して希少な転写産物バリアントを検出するためのチップベースのデジタルPCR

Abstract

出典:Molinari, C., et al.チップベースのデジタルPCRによる新鮮凍結胃癌組織におけるCDH1希少転写産物変異体の検出。 J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、チップベースのデジタルPCRを示しています。これは、希少な転写産物のバリアントを検出するのに役立つデジタルPCR技術のバリエーションです。PCR反応はナノ流体チップのチャンバーに分割され、それぞれが独立した反応として機能します。増幅されたターゲットを持つチャンバーからの蛍光シグナルの検出により、サンプル中にまれな転写産物バリアントが存在することが確認されます。

Protocol

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

>注:この手順は、ヒトの新鮮凍結組織中の少数のcDNA分子を検出するために特別に設計されています。組織切片は、以前に検証された患者由来の胃腫瘍または正常組織サンプルから、凍結したままドライアイスで切断されています。

1. RNAの単離と精製

1. RNA抽出
   手記：RNA単離は、特定の製品を使用して内部で行われます(材料の表を参照)。ただし、さまざまなアイソレーションキットが市販されています。
   1. 細かくカットした新鮮凍結組織サンプル50 - 100 mgを1.5 mLチューブに入れ、1 mLのRNA単離試薬と15秒間激しくボルテックスしてホモジナイズします。チューブを-80°Cで一晩インキュベー
   トします。
   2. サンプルを含むチューブを室温で5分間インキュベートし、15秒間ボルテックスして混合します。
   3. チューブを氷上に置き、200 μLのクロロホルムを加え、15秒間激しくボルテックスします。
   4. チューブを室温で60秒間インキュベートし、12,000 x

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
トリアゾール試薬	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15596018
グリコーゲン 20 mg/ml	ロシュ	10901393001
RNeasy MinElute クリーンアップキット	キアゲン	74204
iScript cDNA合成キット	バイオラッド	1708891
QuantStudio 3DデジタルPCRマスターミックスv2	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A26358 の
CDH1a IDTカスタムデザインアッセイ	統合DNAテクノロジー(IDT)	NAの	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR最適化アッセイ濃度:900 nM (F)、900 nM (R)、250 nM (P)]
QuantStudio 3D デジタル PCR 20K チップキット v2	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A26316 (英語)
ヘレウス・バイオフージ・フレスコ	サーモサイエンティフィック	75002402
サーモサイクラー(Labcycler)	センソクエスト	011-103
GeneAmp PCRシステム 9700	サーモフィッシャーサイエンティフィック	N805-0200
デュアルフラットブロックサンプルモジュール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4425757
QuantStudio 3D チルトベース、デュアルフラットブロック GeneAmp PCR システム 9700	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4486414
フラットブロックサーマルサイクラー用QuantStudio 3DデジタルPCRチップアダプターキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4485513
QuantStudio 3DデジタルPCRチップローダー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4482592
QuantStudio 3DデジタルPCR装置(電源コード付き	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4489084