$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>注:このプロトコルに必要な溶液とバッファーのレシピは、表1に記載されています。
1. ドットブロット
- プラスミドDNAスタンダードの調製
- AAVベクターゲノムプラスミドDNAを水またはTris-HCl緩衝液(10 mM、pH 8.0)で10 ng/μLに希釈します。この希釈液を25 μL取り、適切な制限酵素で1時間消化し、反応容量50 μLでプラスミドDNAを直鎖化します
手記：ダイジェストの複製セットを作成します(ステップ1.4.1を参照)。適切な酵素は、プラスミドDNAをドットブロットプローブ結合領域の外側に切断する酵素である必要があります。便宜上、希釈したプラスミドDNAを分注(25 μL/チューブ)し、将来の使用のために-20°Cで凍結保存することができます。ステップ5.1でチューブを振とうしながらプラスミドDNAを消化します。プラスミドDNA標準試料を過剰に消化しないでください。
- 消化されたプラスミドDNAスタンダードの入ったチューブに450 μLの水またはTEを加え、十分に混合します。この混合物の70 μLを、1,330 μLの水またはTEを入れた新しい1.5 mL微量遠心チューブに移し、希釈プラスミド標準試料(25 pg/μL)を調製します。
- 表1に従って、2倍段階希釈液(600 μL/チューブ)のセットを作成します。希釈液を5秒間ボルテックスして完全に混合します。
- 標準試料およびウイルスDNAサンプルの変性
- 各標準希釈液に600 μLの2倍アルカリ溶液を加えます。5〜10秒間ボルテックスしてよく混ぜます。室温で10分間インキュベートします。
- 各ウイルスDNAサンプルに120 μLの2倍アルカリ溶液を加えます。5〜10秒間ボルテックスしてよく混ぜます。室温で10分間インキュベートします。
- ドットブロット装置のセットアップ
- はさみを使用して、ブロッティング(ゼータプローブなど)メンブレンをサンプル数と標準品の数に適したサイズにカットします。メンブレンを水で10分間浸してから、ドットブロット装置に置きます。メンブレン装置の未使用のウェルを覆います.
手記：メンブレンは清潔なピンセットで取り扱ってください。空のウェルをカバーするために、メンブレンに付属の水色の保護シートを使用できます。サンプルや標準物質を結合する前にメンブレンを乾燥させないでください。装置の組み立てと使用の詳細については、ユーザーマニュアルを参照してください。
- サンプルをロードする井戸に水を追加します。真空を適用し、ウェルから水を引っ張ってエラーをチェックし、修正したら再テストします。真空を適用しながらネジを締め直し、しっかりと密閉します。
手記：シーリングが不完全な場合、ウェル間でサンプルが漏れる可能性があります。
- 水が完全に引き込まれたら、真空を完全に解放します(つまり、真空マニホールドを空気圧に対して開いている必要があります)。
- ドットブロット装置への標準試料およびサンプルのローディング
- 希釈したプラスミドDNA標準試料各400 μLを各ウェルに適用し、標準希釈液を4レーン実行します。標準ダイジェストの2つの別々のアリコートを使用し、それぞれを重複してロードします。各ウイルスDNAサンプルに200 μL/ウェルを塗布します。
手記：残りの~40 μLの変性サンプルを使用して、希釈したサンプルを調製し(例:20 μLのサンプルと180 μLの1xアルカリ溶液を使用した10倍希釈サンプル)、必要に応じてブロットすることができます。
- 穏やかな真空を適用して、DNA溶液をウェルに引き込みます.
手記：真空圧は、ドットブロット装置と大気に真空圧が加わるように(つまり、ストップコックアームが約45°の角度で配置され、吸引音が大きくなるように)、三方弁を部分的に開いて調整する必要があります。
- すべてのウェルが空になったら、三方弁を調整して真空を解除します。400 μLの1xアルカリ溶液を、標準試料とサンプルを含む各ウェルに加えます。5分間待ってから、バキュームを再度適用してウェルを空にします。
- 同様に掃除機を再度適用します。
- ドットブロット装置を真空下で分解し、メンブレンをはがし、2x SSCですすいでください。DNA結合面を上にして、メンブレンを清潔なペーパータオルの上に置き、余分な2x SSCを取り除きます。
- 適切なUV架橋剤を用いて、ブロットしたDNAをメンブレンにUV架橋すると、メンブレンはハイブリダイゼーションの準備が整いました。
手記：ウェットメンブレンはUV架橋に使用できます。乾燥させたUV架橋メンブレンは、室温で保存することができます。詳細については、資料の表をご覧ください。
2. ハイブリダイゼーションと洗浄
- ハイブリダイゼーションバッファーを65°Cのウォーターバスで温めます。
- 放射性 α-32P dCTP で DNA プローブを酵素的に標識し、製造元の推奨に従って市販のキットを使用して精製します。
手記：ウイルスゲノムのエンハンサープロモーター領域またはタンパク質コード配列からの長さ0.5〜2.0 kbのプローブを使用します。このプロトコルでは、シグナル検出に32個のP標識放射性プローブを使用しますが、非放射性化学発光プローブまたは蛍光プローブも使用できます(ディスカッションセクションを参照)。
- DNA結合面を上にしてメンブレンをハイブリダイゼーションボトルに入れ、5 mLの予熱済みハイブリダイゼーションバッファーでメンブレンをすすぎ、バッファーを廃棄します。次に、予め加温したハイブリダイゼーションバッファー10 mLを加え、ボトルを65°Cに設定した回転ハイブリダイゼーションオーブンに置き、≥5分間回転させます。
- 10 mg/mL の 20 μL を剪断したニシンまたはサケの精子 DNA 溶液と 32P 標識プローブ (≥107 cpm) を 100 °C に設定したヒートブロックにチューブを置いて 5 分間変性させます。次に、氷の上で≥2分間スナップチルし、短時間回転させ、使用するまで氷の上に置いておきます。
注意：放射性DNAプローブの場合、スクリューキャップとOリング付きの1.5 mLチューブを使用する必要があります。
- 変性した精子DNAと放射性プローブをハイブリダイゼーションボトルのハイブリダイゼーションバッファーにすばやく加え、ボトルを10秒間振って混合します。ボトルを65°Cオーブンに戻し、ボトルを65°Cで回転させて≥4時間インキュベー
トします。
- ハイブリダイゼーションが完了したら、回転を停止し、ハイブリダイゼーションボトルを取り外し、漏れ防止プラグシールキャップ付きの50mLコニカルチューブに放射性プローブ溶液を注ぎます。プローブは、放射性物質専用の冷蔵庫に入れた適切な容器に保管してください。
手記：4°Cで保存したプローブ付きの使用済みハイブリダイゼーションバッファーは、ハイブリダイゼーションバッファーを含む漏れ防止プラグシールキャップ付きの50 mLコニカルチューブを100°Cのウォーターバスに5分間置くことで、少なくとも5回再利用できます。
- 65°Cに加熱したWash Bufferでメンブレンを洗浄し、ハイブリダイゼーションボトルに20〜30mLのWash Bufferを加え、5分間回転させます。この洗浄をさらに2回繰り返します
手記：洗浄液の放射能を測定し、地元の研究所の要求に応じて記録します。
- メンブレンを洗浄しながら、蛍光体イメージングスクリーンを画像消去器に5分間置きます。
- 3回目の洗浄後、ハイブリダイゼーションボトルからメンブレンを取り外し、ペーパータオルでメンブレンの余分なバッファーを取り除き、メンブレンを透明なプラスチックペーパーホルダーに入れます。ガイガーカウンターを使用してメンブレン上の放射性信号を確認します。消去した蛍光体イメージングスクリーンをメンブレンに10分間、信号強度に応じて一晩放置します。
- 蛍光体画像スキャンシステムを使用して画面をスキャンし、各ドットの信号強度に関するデータを取得します。
>表1:定量的ドットブロットプラスミドDNA標準液。2倍段階希釈(600 μL/チューブ)によるプラスミドDNA標準液の調製に必要な容量の25 pg/μLプラスミドDNA標準液と水またはTEが示されています。プラスミドDNA標準カラム(0.039〜5 ng)の数値は、各プラスミドDNA標準溶液の200 μL中のDNA量です。
名
名
名
名
名
名
名
名
名
名
名
%
名
名
名
名
| プラスミドDNA標準試料(ng) | 25 pg/μL プラスミド DNA 標準溶液の容量 (μL) | 水の量(μL) | 総容量 (μL) |
| 5 | 600 | 0 | 600 |
| 2.5 | 300 | 300 | 600 |
| 1.25 | 150 | 450 | 600 |
| 0.625 | 75 | 525 | 600 |
| 0.313 | 37.5 | 562.5 | 600 |
| 0.156 | 18.8 | 581.2 | 600 |
| 0.078 | 9.4 | 590.6 | 600 |
| 0.039 | 4.7 | 595.3 | 600 |