組織溶解液中の標的タンパク質を推定するための定量的ドットブロット

要約

出典:Qi, X., et al.定量的ドットブロット分析(QDB)を使用して、組織レベルで選択したタンパク質の含有量をハイスループットで絶対的に測定します。J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオでは、組織サンプル中の対象タンパク質の絶対定量のための定量的ドットブロット(QDB)技術を示しています。サンプル中のタンパク質は、QDBプレートのウェル内のニトロセルロースメンブレンに固定化されます。ペルオキシダーゼ酵素で標識された標的タンパク質特異的抗体を利用して、化学発光基質を酸化して光を生成し、これを測定してサンプルのタンパク質濃度を決定します。

プロトコル

1. サンプル調製

1. 50 mgのマウス組織を1.5 mLのチューブに取ります。.200 μL 溶解バッファー (50 mM HEPES、pH 7.4、137 mM NaCl、5 mM EDTA、5 mM EGTA、1 mM MgCl₂、10 mM Na₂P₂O₇、1% Triton X-100、10% グリセロール) を添加し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤 (100 mM NaF、0.1 mM フェニルメチルスルホニルフッ化物、5 μg/mL ペプスタチン、10 μg/mL ロイペプチン) を添加します。 5 μg/mL アプロチニン)。
2. ホモジナイザーで組織を氷上で1分間均質化します。
3. 8,000 x g、4°Cで10分間遠心分離します。
4. 上清を新しいチューブ(1.5 mL)に集め、BCAキットによるタンパク質濃度アッセイのために1 μLを取り出します><。 注:ウェスタンブロット解析およびドットブロット解析に一般的に使用されるすべての溶解バッファーは、QDB解析に使用できます。

2. 抗体の特異性の決定

1. ウェスタンブロット分析用に、セクション1.4のサンプルライセート(20 μg)、IgGフリーBSA(20 μg)、および標準タンパク質(600 pg)を調製します><。 注:IgGフリーBSAはネガティブコントロールとして使用され、標準タンパク質はポジティブコントロールとして使用されます。抗体の特異性は、ウェスタンブロット分析を使用して適切なサイズの1つのバンドを示すことによって実証されます。

3. QDB解析の線形範囲の定義

1. 標準タンパク質をddH₂Oで溶解し、タンパク質を1,200 pg/μLの濃度に希釈します。
2. 調製したサンプルから濃縮タンパク質をセクション1.4〜4 μg/μLに希釈します。
3. BSAをddH₂Oで溶解し、タンパク質を1,200 pg/μLおよび4 μg/μLの濃度に希釈します。
4. 標準タンパク質および調製サンプルの一連の希釈液を、表1および表2のガイダンスに従って調製しました。
5. 10 μL の希釈標準タンパク質または希釈調製サンプルと 10 μL の 2x ローディングバッファー (120 mM Tris-HCl pH 6.8、20% グリセロール、4% SDS、0.2% ブロムフェノールブルー、200 mM DTT) を混合します。
6. 混合物を85°Cで5分間加熱します。

4. QDB解析の流れ

1. サンプル・アプリケーション
   1. プレートの底がテーブルの表面に触れないように、QDBプレートを支えます。たとえば、空のピペットチップボックスをサポートとして使用します。
   2. サンプルを最大2μLまで、QDBプレートの個々のユニットの下部にあるメンブレンの中心にロードします。
2. プレートの乾燥
   1. 負荷をかけたQDBプレートを室温(RT)で1時間放置するか、または代わりに、負荷をかけたプレートを37°Cで15分間換気の良い場所に置いておきます。
3. プレートのブロッキング
   1. QDBプレートをトランスファーバッファー(0.039 M Glycine、0.048 M Tris、0.37% SDS、20%メチルアルコール)に浸し、プレートを10秒間静かに振とうします。
   2. QDBプレートをTBST(トリス緩衝生理食塩水、0.1%Tween 20)で3回穏やかにすすぎ、TBSTでプレートを絶えず振とうしながら5分間洗浄します。
   3. ブロッキングバッファー(TBST(100 μL/well)中の5%脱脂乳)でQDBプレートを1時間、絶えず振とうしながらブロッキングします。
4. 一次抗体のインキュベーション
   1. ブロッキングバッファー中の一次抗体を選択した濃度(1:500から1:5,000)で希釈し、通常の96ウェルプレートの各ウェルに100 μLを添加します。QDBプレートを96ウェルプレートに挿入し、組み合わせたプレートを室温で2時間、または一定の振とうの下で4°Cで一晩インキュベー
   トします。
   2. あるいは、QDBプレートをボックス内に置き、プレート全体に同じ抗体を使用する場合は、プレートのメンブレン部分から2〜3 mm上にブロッキングバッファーをボックス内に充填します。選択した濃度で一次抗体を添加し、プレートを室温で2時間、または一定の振とう下で4°Cで一晩インキュベートします。
   3. プレートをTBSTで3回やさしくすすいでから、TBSTで3回、絶えず振とうしながら毎回5分間洗浄します。
5. 二次抗体インキュベーション
   1. ブロッキングバッファーで二次抗体を選択した濃度(1:1,000から1:50,000)で希釈し、セクション4.4.2で説明したように100 μL/ウェルを96ウェルプレートまたはボックス内で分注し、ロードした96ウェルプレートまたはボックス内で、一定の振とう下でRTで1時間QDBプレートをインキュベー
   トします。
   2. QDBプレートをTBSTで3回優しくすすぎ、次にTBSTでプレートを3回、TBSTでそれぞれ5分間、絶えず振とうしながら洗浄します。
6. 定量化
   1. メーカーの指示に従って、増強化学発光基質(ECL)を調製します。
   2. ECL基質を96ウェルプレート(100 μL/ウェル)に分注し、QDBプレートを96ウェルプレート内に2分間挿入し、一定の振とうを行います。
   3. 96ウェルプレートからQDBプレートを取り外し、短時間振とうして余分な液体を取り除きます。プレートを白いマイクロタイタープレートに置きます。
   4. マイクロプレートリーダーの電源を入れ、ユーザーインターフェースで「カバー付きプレート」を選択してから、結合プレート(QDBプレート+ホワイトプレートアダプター)を定量化のためにマイクロプレートリーダー内に配置します.
      注意: プレートからの干渉を避けるために、白い不透明なマイクロタイタープレートをアダプターとして使用してください。マイクロプレートリーダー内に結合プレート(QDBプレート+96ウェルプレートアダプター)を配置する際にマシンが詰まらないように、「カバー付きプレート」を選択してください。

>表 1.標準タンパク質曲線の希釈スキーム。

名 名 名 % 名 名 名 名 名 名 名

	S1 (0pg/μl)	S2 (33.3pg/μl)	S3 (100pg/μl)	S3 (300pg/μl)	S5 (600pg/μl)	S6 (1200pg/μl)
標準タンパク質(1200pg/μl)	0	1.39	4.17	12.5	25	50
IgGフリーBSA (4pg/μl)	50	48円61銭	45円83銭	37.5	25	0
トータル	50	50	50	50	50	50

>表 2.調製したサンプルの希釈スキーム

名 名 名 % 名 名 名 名 名 名 名

	X1 (0μg/μl)	X2 (0.25μg/μl)	X3 (0.5μg/μl)	X4 (1μg/μl)	X5 (2μg/μl)	X6 (4 μg/μl)
サンプル(4μg/μl)	0	3.125	6.25	12.5	25	50
IgGフリーBSA(4μg/μl)	50	46.875	43円75銭	37.5	25	0
トータル	50	50	50	50	50	50

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マイクロプレートリーダー	テカン	テカンインフィニット200 PRO
QDBプレート	煙台ゼスターン Co.Ltd		プレートは、電子メールまたは訪問 www.zestern.net のいずれかで確認目的でリクエストに応じてご利用いただけます。
ペルオキシダーゼ アフィニピュア ロバ 抗ウサギ IgG (H+L) (min x bov, ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	ジャクソン	〒711-035-152
化学発光基質の強化	熱	32134
ウサギ抗CAPG	シノバイオロジック株式会社	14213からT52
CAPGタンパク質	シノバイオロジック株式会社	14213-HNAE(英語
ヘープス	シグマ	H4034-J
NaCl	天津瑞吉金特殊化学有限公司	10461220
MgCl2	天津Zhiyuan化学試薬有限公司	20120802
EDTAの	シグマ	E9884-500G
エグタ	シグマ	BNN1913
Na2P2O7	海泰漢方薬検査	20160914
トリトンX-100	シグマ	T9284
グリセロール	シグマ	G7757
フェニルメチルスルホニルフッ化物	シグマ	P7626-5G
ペプスタチン	シグマ	Z290033
ロイペプチン	シグマ	L2884
アプロチニン	シグマ	A3428
トリス-HCl	シグマ	T6455
SDSの	シグマ	L5750-500G
DTTの	シグマ	43815から1G
ブロムフェノールブルー	シグマ	B-0126
NaF(ナフ)	シグマ	S7920

) の の シリーズ