タンパク質発現レベルを推定するための定量的ウェスタンブロッティング

要約

出典:Huang, Y. T., et al.標準化された定量的ウェスタンブロッティングを使用して、組織間および発生全体にわたるタンパク質レベルのロバストな比較。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、サンプル中の標的タンパク質発現を定量するための全タンパク質標準化ベースのウェスタンブロッティング技術を示しています。サンプルの全タンパク質染色を利用することにより、レシオメトリック分析を行い、標的タンパク質の相対発現レベルを決定します。

プロトコル

>注:このプロトコルは、再現性を高めるために、標準化された市販のキットと試薬を使用して最適化されています(材料の表を参照)。

1. サンプルの準備

1. タンパク質抽出
   1. -80°Cから急速凍結した細胞または組織サンプルをドライアイスに移し、氷上で解凍し、必要に応じて氷冷した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。不必要な凍結融解サイクルは、タンパク質の品質に影響を与えるため、避けてください。
   2. 1xプロテアーゼ阻害剤を含むラジオ免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファー(25 mM Tris-HCl(pH 7.6)、150 mM NaCl、1% NP-40、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS)を、組織重量あたりの最適量を使用して各サンプルに加えます。
      手記：アプリケーションによっては、均質化バッファーの種類と量をさらに最適化する必要がある場合があります。
   3. ポリプロピレン製乳棒付きのハンドヘルド電動ホモジナイザーを使用して、組織サンプルを均質化します。各サンプルの間に、乳棒を二重蒸留水で洗い、きれいなティッシュで乾かします。異なる実験条件や組織間で乳棒を交換します。
   4. 均質化後、サンプルを氷上に10分間放置します。サンプルを>10,000 x g、4°Cで10分間遠心分離します。
   5. ペレットを乱さずに、上清を氷上の新しいチューブに移します。上清はタンパク質サンプルです。抽出したタンパク質を-80°Cで保存するか、直接タンパク質濃度の測定に進みます。
2. タンパク質濃度の定量化と標準化
   1. ビシンコニン酸(BCA)アッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。製造元の指示に従って、ウェルあたり200μLのBCAミックスを使用して、96ウェル光学プレートでBCAアッセイミックスを調製します
      手記：LowryアッセイやBradfordアッセイなどの他の定量法も、タンパク質濃度が実験間で一貫して定量される限り、タンパク質濃度の決定にも使用できます。
   2. ウシ血清アルブミン(BSA)標準試料を濃度を上げて三重に調製し、各タンパク質サンプル1 μLを二重に添加します。タンパク質濃度が低いと予想される場合は、96ウェルプレートを予熱した60°Cのヒートブロックで10分以上インキュベー
   トします。
   3. インキュベーション後、プレートリーダーを使用して560 nmでの吸収を測定します。
   4. プレートリーダーの測定値をエクスポートし、各サンプルの平均吸光度値をタンパク質標準を使用して得られた標準曲線と比較することにより、タンパク質濃度を計算します。サンプルタンパク質濃度を正確に推定するには、標準曲線のR二乗値が0.98以上である必要があります。
   5. サンプルバッファーと超純水でタンパク質サンプルを希釈して調製することにより、タンパク質の量を正常化します。総容量は、使用するゲルの種類に応じて調整できます。開始量として、レーンあたり30 μgのタンパク質をロードすることをお勧めします。必要に応じて、ジチオスレイトール(DTT;最終濃度5 mM)またはβ-メルカプトエタノール(最終濃度200 mM)などの還元剤を各サンプルに添加します。原液β-メルカプトエタノールをドラフト内でピペットで掴みます。
   6. サンプルを70°Cのヒートブロックで10分間インキュベートし、サンプルを氷の上に置き、ボルテックスし、短時間スピンダウンして収集します。ゲルをロードするまで氷の上に置いてください。

2. タンパク質サンプルのゲル電気泳動

1. デバイスとゲルのセットアップ
   1. プレキャストの4–12% Bis-Trisグラジエントゲル(材料表を参照)をゲル電気泳動チャンバーシステムにセットアップします。使用前に二重蒸留水を使用してゲルをすすぎます.
      注:目的タンパク質のサイズ、相互作用、および存在量に応じて、異なるグラジエント、緩衝剤、またはウェルのサイズと数を持つゲルを使用することができます。
   2. 2回蒸留水で希釈した1x MES SDSランニングバッファーをタンクあたり500 mL加えます。ランニングバッファーを追加した後、スタッキングゲルのウェルを乱さずに、コームをゲルから慎重に取り外します。
2. タンパク質のローディング
   1. 3.5 μLのタンパク質標準をウェルにロードします。サンプルのレイアウトにもよりますが、ゲルの両側にタンパク質ラダーをロードすると、タンパク質サイズをより正確に推定するのに役立ちます。先端の細いゲルローディングチップを使用すると、より正確なサンプルローディングが可能になります。
   2. 膜間標準化に内部標準を使用する場合(以下のステップ5を参照)、タンパク質ラダーの隣にある最初の3つのウェルに他のサンプルと等しい量をロードします。
   3. 残りのウェルに各サンプルの30μgをロードします。すべての空のウェルに1xサンプルバッファーを添加します。
3. 電気泳動
   1. サンプルをロードした後、ゲルタンクを組み立てます。サンプルをスタッキングゲルに80Vで10分間、続いて150Vでさらに45〜60分間分析します。

3. タンパク質の移動

>注:このプロトコールでのタンパク質転写は、市販のセミドライブロッティングシステム(材料の表を参照)を使用して行われ、迅速かつ一貫した結果が得られます。

1. 濾紙を二重蒸留水にあらかじめ浸し、ゲルナイフ、プラスチックパスツールピペット、ブロッティングローラー、および鉗子が使用できる状態になっていることを確認して、タンパク質転写を準備します。
2. すべてのラッピングホイルを慎重に取り除いて、転写スタックを開きます。下部のスタックから上部を取り外し、脇に置きます。下部スタックのメンブレンを数滴の電気泳動ランニングバッファー(2〜3mL)ですばやく湿らせます。トランスファースタックが開いたら、PVDFメンブレンが乾燥するのを防ぐことが重要です。
3. 電気泳動を停止した後、ゲルナイフを使用してプレキャストゲルを開き、スタッキングゲルを切り取ります。ゲルの端をカットして、プラスチックキャストから解放します。ゲルの損傷を防ぐために、ジェルナイフを濡らしたままにしてください。
4. 転写スタックを下から上に組み立てます:ボトムスタック(PVDFメンブレンを含む)、タンパク質ゲル、および濾紙。ブロッティングローラーを使用して、すべての気泡を取り除きます。濾紙の上に一番上のスタックを置き、再度スタックを転がして気泡を取り除きます。強く押しすぎると、タンパク質の転写中にゲルが変形する可能性があるため、押さないでください。
5. デバイスの左側に電極がある状態でスタック全体をトランスファーデバイスに移し、ゲルスポンジをスタックの上に置いて、デバイスの対応する電気接点と位置合わせします。蓋を閉め、適切なプログラムを選択して開始します(開始点は20 Vで7分
を推奨します)。
6. 終了したら、蓋を2分間閉じたままにして、スタックを冷まし、メンブレンが乾燥するのを防ぎます。トランスファースタックを取り外し、メンブレンをゲルサイズにカットします。切断したメンブレンを二重蒸留水で素早く洗浄してから、総タンパク質染色を続けます。

4. 総タンパク質染色

>注:蛍光検出を使用すると、従来のアプローチ(ECL検出など)に比べて、線形範囲と感度をはるかに適切に制御できるため、大きなメリットが得られます。したがって、ステップ4および5では、蛍光TPSおよび蛍光二次抗体を使用します(材料表を参照)。

1. メンブレンを50mLのチューブに丸め、タンパク質側を内側に向けてください。蛍光TPSと二次抗体の光感受性のため、その後のステップはすべて暗闇で行われます。
2. 5 mLのタンパク質染色液(材料表を参照)を加え、ローラー上で室温で5分間インキュベートします。TPSと洗浄バッファーにはメタノールが含まれているため、これらのステップはドラフト内で行ってください。
3. 染色液を廃棄し、5 mLの洗浄液(6.3%酢酸30%メタノール溶液)ですばやく2回洗浄します。洗浄ステップの間にチューブをローラーに短時間戻します。続行する前に、メンブレンを超純水で短時間すすいでください。

5. ブロッキング、抗体インキュベーション、検出

1. メンブレンのブロッキング:メンブレンを含む50 mLのチューブに3 mLのブロッキングバッファー(材料の表を参照)を追加します。メンブレンをローラー上で室温で30分間インキュベートします。抗体の選択によっては、使用するブロッキングバッファーの種類を最適化する必要がある場合があります。
2. 一次抗体のインキュベーション
   1. ブロッキングバッファーを廃棄し、適切な最適化された濃度の一次抗体と交換します(図1および図2:マウス抗SMN、1:1,000、ブロッキングバッファーで希釈)
      手記：一次抗体の適切な最適化には、抗体が適切なサイズのタンパク質産物を検出し、他の非特異的なタンパク質産物への結合を全くまたは最小限に示さないようにすることの確認を含める必要があります。可能であれば、目的のタンパク質に対する複数の抗体を試験し、比較します。
   2. メンブレンをローラー上で4°Cで一晩インキュベートします。翌日、抗体溶液を取り出し、室温(RT)のローラーで1x PBSを使用して5分間6回洗浄します。
3. 二次抗体インキュベーション
   1. 一次抗体の宿主に対して1:5,000の濃度で特異的二次抗体を調製し、5 mLのブロッキングバッファーで調製します。他の二次抗体には、他の希釈剤や代替のブロッキングバッファーの使用が必要な場合があります。
   2. メンブレンを二次抗体溶液とローラー上でRTで1時間インキュベートします。インキュベーション後、メンブレンをローラー上の1x PBSで30分間3回洗浄します。
   3. メンブレンを乾燥させ、検出されるまでアルミホイルを使用してメンブレンを光から保護します。メンブレンは4°Cに保ち、長期保存することができます。
4. 画像取得
   1. スキャナーに接続されているコンピューターにログインします。タンパク質側を下に向けてメンブレンをスキャナーに置き、ソフトウェアでスキャン領域を選択します。
   2. 飽和が発生しないことを確認することにより、両方のチャネル(700 nmと800 nm)のレーザー強度を最適化します。両方のチャンネルで画像を取得し、画像をエクスポートしてさらに分析します(ステップ6)。

6. ウェスタンブロットの分析と定量

>注:これらの推奨事項は、無料で入手できるImage Studioソフトウェアに基づいています。ただし、ImageJなどの他のソフトウェアパッケージを使用して、同等の解析を行うこともできます。

1. ファイルのインポート: 分析に使用するコンピューターにローカル ワークスペースを作成します。これにより、取得したウェスタンブロットの画像ファイルのデータベースが生成されます。スキャナーで取得したファイルをインポートし、分析する画像を選択します。
2. TPS分析
   1. 700 nmチャネルを表示して、総タンパク質染色結果を表示します。TPS画像の一例を図1に示し、新生児(P5)(図1A-B)と10週齢マウス(図1C-D)の異なる組織を直接比較します。同様に、図2は、異なる年齢のマウスの脳組織を直接比較した例を示しています。
   2. 右上隅の [分析] タブを選択し、[四角形の追加] を選択して、正規化の対象領域を定義します (図 1B、D)。最初の長方形領域をコピーして個々のサンプルに貼り付け、定義された領域が分析されたすべてのレーンで同じサイズになるようにします。
   3. ソフトウェアの左下隅にある[形状]タブから結果をコピーします。
3. 定量化
   手記：サンプルを定量するための最適なアプローチは、実験デザインによって異なります。ここでは、時間の経過とともに減少することが知られている生存運動ニューロンタンパク質(Smn;神経筋疾患脊髄性筋萎縮症に関与する主要なタンパク質)の検出と、Smnシグナル強度のTPSへの正常化がタンパク質発現発達の信頼性の高い推定をどのように提供するかの実例を提供します。
   1. 図2は、TPSをタンパク質ローディングコントロールとして使用した動物の年齢増加に伴うSmn発現の減少を示しています。ステップ6.2.1〜6.2.3を繰り返して、タンパク質のローディングを定量化します(図2B)。800 nmチャネル(図2A)でステップ6.2.1〜6.2.3を繰り返して、目的のタンパク質を分析します。
   2. TPSと目的のタンパク質の両方から結果をスプレッドシートプログラムにコピーします。スプレッドシート上で、まず、最も高いTPSシグナルを決定し、各TPSシグナル値をこの値で割って正規化されたタンパク質ローディング値を取得することにより、タンパク質ローディングを正規化します。
   3. 個々のサンプルの 800 nm シグナル値を、対応する正規化されたタンパク質値で除算して、異なるサンプルにおける相対的なタンパク質発現比を計算します。
   4. 最初の標準化後、さまざまな時点または組織を内部標準の平均値と比較し、異なるメンブレンや実験間で直接比較できるようにします。

結果

図 1.2つの異なる年齢のマウス組織におけるTPSおよびSmnタンパク質レベルを示すウェスタンブロット。P5(A)および10週齢(C)マウスのTPSおよびSmnタンパク質。(B、D)全レーンTPSの蛍光強度を計算し、(任意の単位で)示しました。M:マーカー/タンパク質標準;kDa:キロダルトン;a.u.: 任意の単位;P5:生後5日目。10W:10週間。

図 2.異なる発生時点におけるマウス組織におけるSmn発現の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
先端の細いゲルローディングのヒント	アルファ研究所	GL20057SNTL
HALTプロテアーゼ阻害剤カクテル、EDTAフリー100x 5mL	サーモフィッシャーサイエンティフィック	78437
ハンドヘルドホモジナイザー	VWRコレクション	〒431-0100
iBlot 2 ゲル転写デバイス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	IB21001
iBlot Transfer Stack, PVDF, レギュラーサイズ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	IB401031
イメージスタジオライト	リコー	該当なし	https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ から無料でダウンロード
IRDye 800CW二次抗体	リコー	--	一次抗体の宿主に対して特異的な適切な二次抗体を選定してください。
マイクロBCAタンパク質アッセイキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23235
Novex Sharp 染色済みタンパク質標準試料	サーモフィッシャーサイエンティフィック	LC5800
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels、1.0 mm、15 ウェル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NP0323BOX
NuPAGE LDS サンプルバッファー (4X)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NP0007
NuPAGE MOPS SDS ランニングバッファー (20倍)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	NP0001
オデッセイ ブロッキングバッファー	リコー	〒927-40000
精製マウス抗SMN(生存運動ニューロン)モノクローナル抗体	BDトランスダクションラボラトリ	610646	SMN/SMAの文献で広く使用されており、ロット番号に関係なく一貫した結果が得られます
REVERT Total Protein Stain、250 mL	リコー	〒926-11021
REVERTウォッシュソリューション	リコー	〒926-11012
RIPA溶解および抽出バッファー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	89900
XCell SureLockミニセル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	EI0001

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