細胞の不均一性を決定するためのシングルセルウェスタンブロッティング

要約

出典:Wang, L., et al., Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (2019).

このビデオでは、不均一な懸濁液中のシングルセルウェスタンブロッティングチップに捕捉された個々の細胞の組成を特定するシングルセルウェスタンブロッティング技術について説明しています。この技術は、標的細胞に特異的なタンパク質マーカーにタグ付けされた蛍光色素の蛍光強度を検出します。

プロトコル

1. シングルセルウェスタンブロット(scWB)分析による細胞懸濁液中の細胞組成の決定

1. scWBチップを再水和してから、ペトリ皿中の1x懸濁液バッファー15 mLでRTで少なくとも10分間使用してください。
2. 希釈したシングルセル懸濁液1mL(10,000-100,000細胞/mL)を再水和チップに加えます。表面を10cmのシャーレの底に置きます。表面が平らに設定されていることを確認します。
3. 乾燥を防ぐためにシャーレに蓋をし、細胞を勾配で5〜15分間落ち着かせます。
4. チップを明視野顕微鏡の下に置き、ウェルを10倍の倍率で検査します.
   手記：マイクロウェルの約15〜20%は1つの細胞で占めるべきであり、ウェルの2%未満が2つ以上の細胞を含むべきである。
5. チップが入った10cmのシャーレを45度傾けます。
6. 1x懸濁液バッファーでチップを洗浄し、チップの上から下に向かって穏やかにピペッティングして、未捕捉の細胞をチップの表面から除去します。3回繰り返します。
7. シングルセルのウェスタン機器を準備します。
8. 溶解時間、電気泳動時間、UV捕捉時間を設定します。基底膜由来ゲルプラグから回収された動員マクロファージを分析するには、次の設定を使用します:溶解時間:0秒;電気泳動時間:160秒;UVキャプチャ時間240秒
9. チップをシングルセルウェスタン機器の電気泳動セルに慎重にロードし、ゲル側に面します。チップのゲル面を傷つけないように注意してください。
10. 溶解/ランニングバッファーをチャンバーに注ぎ、シングルセルウェスタンチップ全体を完全に覆います。細胞溶解を開始します。
11. 1.8に記載されている設定を使用してscWB機器を実行します。
12. 実行が完了したら、チップを10cmのシャーレに移し、1x洗浄バッファーでチップをRTで10分間2回洗浄します。
13. 一次抗体(抗ビンキュリン:1:10、抗CD45:1:15、抗CD11b:1:20、抗F4/80:1:10)を総量80 μLの抗体希釈液(8 μLの抗体1と8 μLの抗体2と64 μLの希釈液を混合)で希釈液を調製します。
14. 一次抗体溶液80 μLを抗体プローブチャンバーに加え、チップのゲル側を下にして下げ、抗体溶液がチップ全体に吸い付くようにします。
15. 一次抗体溶液と室温で2時間インキュベートします。
16. チップをシェーカーの1x洗浄バッファーで10分間3回洗浄します。
17. チップをシェーカーの水で10分間1回洗い、ゲルを脱塩します。
18. 1:20 希釈の二次抗体を総容量 80 μL で調製します (2 μL の二次抗体と 78 μL の希釈液を混合します)。
19. チップを二次抗体と室温で1時間インキュベートし、光から保護します。
20. シェーカーの1x洗浄バッファーでチップを10分間3回洗浄します。
21. スライドスピナーを使用してチップを回転させ、残っている洗浄バッファーをすべて取り除きます。
22. デュアルレーザーマイクロアレイスキャナーで、二次抗体に結合した蛍光色素のスペクトルチャネルで5 μmの分解能でチップをスキャンします。
23. scWB専用ソフトウェアを使用してデータを解析します。

2. scWBチップの除去

1. スキャンしたチップは、ストリッピングの準備ができるまで洗浄バッファーに保管します。
2. ウォーターバスをヒュームフードに入れます。
3. 50 mLチューブラックをウォーターバスに置き、水をラックのちょうど1 cm上に置き、水温を60°Cに設定します。
4. ストリッピングバッファを準備します。ストリッピングバッファー液1Lについて、9.85gのTris-HCl(pH 6.8)と20gのSDSを900mLの蒸留水に溶解し、pHを調整します。次に、蒸留水で1Lまで充填し、各使用の直前に0.8%(v / v)のβ-メルカプトエタノール(β-ME;14.3M)を追加します。
5. 最初のスキャン後、ストリッピングする前にチップを10cmのシャーレに入れます。
6. チップごとに40 mLのストリッピングバッファーを取り、320 μlのβ-ME.
   を加えます。 注意: β-MEは有毒で、人間や環境に有害です。次の手順は、ドラフトで行う必要があります。
7. チップをキャニスターに入れ、キャニスターに水が漏れないようにパラフィルムでキャニスターを密封
します
8. キャニスターを事前に温めたウォーターバスのチューブラック内に置きます。
9. 90分間インキュベートします。
10. キャニスターからチップを慎重に取り出し、新しいシャーレに入れます。
11. チップを1xウォッシュバッファーで1回短時間洗浄します。次に、1x洗浄バッファー15 mLをペトリ皿に加えます。
12. チップをシェーカーで15分間洗います。洗浄手順を4回繰り返します
    手記：チップが次の一次抗体の準備ができています(ステップ1.12〜1.21を参照)

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10cmシャーレ	グリナーバイオワン	664 160
10xサスペンションバッファー	プロテインシンプル	R101
15cmシャーレ	隼	353025
2-メルカプトエタノール	MPバイオメディカル	2194705
5%洗浄バッファー	プロテインシンプル	R252
抗体希釈剤	プロテインシンプル	〒042-203
ベンチトップ遠心分離機	ベックマン・コールター		Microfuge 22R Centrifuge(マイクロフュージ 22R Centrifuge)
ウシ血清アルブミン	シグマ・アルドリッチ	A7906-100G
カルセインAM	サーモフィッシャー	C3099	1 mL
CD11bの	ノーバスバイオロジカルズ	NB110-89474
CD45 (D4H7K) ウサギ mAb	細胞シグナル技術	727987S
CD68/SR-D1 (FA-11)	ノーバスバイオロジカルズ	NBP2-33337SS
セロメータビジョン	ネクセロム
ディスパーズ	BDの	354235	100ミリリットル
解剖ハサミ
ロバ抗ウサギIgG二次抗体 [NL557]	ノーバスバイオロジカルズ	NL004	NL 557 コンジュゲート
Donkey anti-Rat IgG (H+L) 二次抗体 [DyLight 650]	ノーバスバイオロジカルズ	NBP1-75655	DyLight 650コンジュゲート
F4/80 (CI-A3-1)	ノーバスバイオロジカルズ	NB600-404SS
ヒートブロック	エッフェンドルフ	22331	サーモミキサー
溶解/ランニングバッファー	プロテインシンプル	R200
マトリゲル基底膜マトリックス(成長因子の減少)	BDの	354230	10ミリリットル
マイクロアレイスキャナー	パーキンエルマー	スキャンアレイGX
マイクロ遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	05-408-129
顕微鏡	サーモフィッシャー	エボスFL
ミロ	プロテインシンプル		シングルセルウェスタン
針	BDの	305111	26グラム
パラフィルム
プロービングチャンバー	プロテインシンプル	035-020
組換えマウスCCL2/JE/MCP-1タンパク質	研究開発	479-JE-050
scWESTチップ	プロテインシンプル	C300
シェーカー	バイオエクスプレス		Gene mateオービタルシェーカー
シングルセルウェスタンチップキャニスター	プロテインシンプル	035-118
スライドスピナー	ラブネット	C1303-T型
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	フィッシャーサイエンティフィック	BPの166-500
注射器	BDの	309602	1 mL
トリス塩酸塩	フィッシャーサイエンティフィック	BPの153-500
ピンセット	プロテインシンプル	035-020
ウォーターバス	サーモフィッシャー

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