タンパク質プロセッシングのための化学発光ウェスタンブロットアッセイ

要約

出典: Hillert-Richter, L. K. et al., Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオでは、免疫沈降したライセートの化学発光に基づくウェスタンブロッティングについて説明しています。この技術は、タンパク質のプロセシングと活性化を決定するのに役立ちます。検出される化学発光シグナルは、その活性化中のタンパク質プロセシングのレベルに比例します。

プロトコル

T細胞実験は、倫理協定42502-2-1273 Uni MDに従って行われました。

1. 実験のための細胞の準備

>注:この免疫沈降の平均細胞数は1 × 10⁷です。付着細胞は、実験の日に1×10⁷個の細胞が存在するように、実験の1日前に播種する必要があります。

1. 実験のための接着細胞の調製
   1. 実験開始の1日前に、14.5cm皿の各条件について、20mLの培地(組成については材料の表を参照)に5〜8×10個の⁶つの接着細胞を播種します。
   2. 実験当日は、細胞が80〜90%コンフルエントで、ディッシュに付着していることを確認してください。培地を廃棄し、接着細胞に新鮮な培地を加えます。
2. 実験のための浮遊細胞の準備
   1. 実験開始直前に、14.5 cm皿の条件ごとに、10 mLの培地(組成については材料表を参照)に1個×10個の浮遊細胞を慎重に配置します。
   2. 初代細胞を使用する場合は、前述の手順に従って初代T細胞を単離します。初代T細胞を1 μg/mLの植物血球凝集素で24時間処理し、続いて25 U/mLのIL2を6日間処理します。
   3. 実験開始直前に、14.5cm皿の条件ごとに10mLの培地(組成については材料の表を参照)に1×10個の8個の初代T細胞を慎重に配置します
      手記：初代T細胞は小さいため、この数が多いことが推奨されます。

2. CD95L刺激

1. CD95L(前述のとおりに製造されたもの、または市販されているもの(材料表参照))で細胞を刺激する
   手記：CD95Lの濃度と刺激時間は細胞の種類に依存します。1つの刺激条件を2回準備して、「ビーズコントロール」サンプルを並行して生成します。
   1. 選択した濃度のCD95Lで接着細胞を刺激します。プレートを斜めに保持し、接着細胞に触れずにリガンドを培地にピペットで移します。
   2. リガンド溶液を細胞懸濁液にピペットで移すことにより、CD95Lで浮遊細胞を刺激します。

3. 細胞の採取と溶解

1. セルディッシュを氷の上に置きます.
   手記：媒体を捨てないでください。死にかけている細胞は培地中に浮遊しており、分析に重要です。
2. 細胞懸濁液に10 mLの冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、付着した細胞をプレートからこすり落とします。細胞懸濁液を50mLのチューブに集めます。
3. 細胞皿を10 mLの冷たいPBSで2回洗浄し、洗浄溶液を同じ50 mLチューブに入れます。細胞懸濁液を500 × gで5分間、4°Cで遠心分離します。
4. 上清を捨て、細胞ペレットを1mLの冷たいPBSで再懸濁します。細胞懸濁液を1.5mLチューブに移します。
5. 細胞懸濁液を500 × gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットを1 mLの冷たいPBSで再懸濁します。
6. 細胞懸濁液を500 × gで5分間、4°Cで遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを1 mLの溶解バッファー(4%プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む)で再懸濁します。氷上で30分間インキュベートします。
7. ライセートを最大速度(~17,000 × g)で15分間、4°Cで遠心分離します。
8. 上清(ライセート)をきれいなチューブに移します。ペレットを捨てます。ライセート50μLを別のチューブに取ります。Bradfordアッセイでタンパク質濃度を分析し、バイアル中の25μgのタンパク質に対応するライセートの量を取ります。ローディングバッファー(組成については材料の表を参照)をバイアルに加えます。ライセートコントロールとして-20°Cで保存してください。

4. 免疫沈降 (IP)

1. 2 μLの抗APO-1抗体と10 μLのプロテインAセファロースビーズ(メーカーが推奨するように調製)をライセートに加えます。ライセート(刺激サンプル)が入った別のチューブにビーズを10 μLだけ加えると、「ビーズコントロール」が生成されます。
   手記：開口部の広いピペットチップは、チップをカットするか、プロテインAセファロースビーズを取り扱う際にIP用の特別なチップを購入して使用します。
2. ライセートと抗体/プロテインAセファロースビーズの混合物を4°Cで一晩穏やかに混合してインキュベートします。ライセートと抗体/プロテインAセファロースビーズを500 × gで4分間、4°Cで遠心分離します。上清を捨て、ビーズに冷たいPBS1 mLを加え、このステップを少なくとも3回繰り返します。
3. 上清を捨てます。ビーズを吸引するには、できれば50μLのハミルトンシリンジを使用してください。

5. ウェスタンブロット

1. ビーズに20 μLの4倍ローディングバッファー(組成については材料表を参照)を加え、95°Cで10分間加熱し、ライセートコントロールを95°Cで5分間加熱します。
2. ライセート、IP、およびタンパク質標準試料を12.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲルにロードし(ゲル調製については、材料表を参照)、80 Vの定電圧で運転します。
3. SDSゲルからタンパク質をニトロセルロースメンブレンに移します.
   手記：ここでは、目的のタンパク質に最適化されたセミドライ技術を使用して、12 分間(25 V; 2.5 A= 一定)以上の転写を行いました。ニトロセルロースメンブレンと2つのミニサイズトランスファースタックを電気泳動バッファー(組成については材料表を参照し、製造元の指示に従って調製)に数分間浸してから、ウェスタンブロッティングを行います。
4. ブロットしたメンブレンを箱に入れ、ブロッキング溶液(0.1% Tween-20 in PBS(PBST)+ 5% milk)で1時間ブロッキングします。メンブレンをブロッキング溶液と穏やかに攪拌しながらインキュベートします。
5. メンブレンをPBSTで3回、各洗浄で5分間洗浄します。

6. ウェスタンブロット検出

1. 示された希釈率(材料表を参照)で最初の一次抗体をメンブレンに添加し、穏やかに攪拌しながら4°Cで一晩インキュベートします。
2. メンブレンをPBSTで3回、各洗浄で5分間洗浄します。
3. メンブレンを20 mLの二次抗体(PBSTで1:10,000に希釈+ 5%牛乳)と室温で1時間穏やかに振とうしながらインキュベートします。
4. メンブレンをPBSTで3回、各洗浄で5分間洗浄します。
5. PBSTを廃棄し、約1 mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ基質をメンブレンに加えます。.
6. 化学発光シグナルを検出します(材料の表を参照).
   手記：露光時間とキャプチャされた画像の数は、細胞内のタンパク質の量と使用する抗体の特異性によって異なります。これは、検出に使用される各抗体について経験的に確立する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12.5% SDSゲル	自力		2つの分離ゲルの場合:3.28 mL蒸留H2O 2.5 mLトリス;pH 8.8;1.5 M 4.06 mLアクリルアミド100 μL 10% SDS 100 μL 100 μL 10% APS 7.5 μL 2つの収集ゲル用TEMED:3.1 mL蒸留H2O 1.25 mLトリス;pH 6.8;1.5 M 0.5 mLアクリルアミド50 μL 10%SDS 25 μL 10% APS 7.5 μL TEMED
14.5cmセルディッシュ	グライナー	639160
アクリルアミド	カール・ロス	A124.1 (日本語)
エアロゾルフィルターピペットチップ、高回収フィルターと広いオリフィス	VWRの	46620-664 (北米) または 732-0559 (ヨーロッパ)	ビーズをライセートにピペッティングするために使用
ビーズをライセートにピペッティングするために使用	シグマ・アルドリッチ	A2103の	希釈率:PBSTで1:4000 + NaN3で1:100
抗APO-1抗体	これらの実験ではP.クラマー教授によって提供され、またはENZOによって購入することができます	ALX-805-038-C100	免疫沈降にのみ使用
抗カスパーゼ-10 Ab	バイオゾール	MBL-M059-3	希釈率:PBSTで1:1000 + NaN3で1:100
抗カスパーゼ-3 Ab	細胞シグナル伝達	9662 S	希釈率:PBSTで1:2000 + NaN3で1:100
アンチカスパーゼ-8 Ab C15	これらの実験ではP.クラマー教授によって提供され、またはENZOによって購入することができます	ALX-804-242-C100	希釈率:PBSTで1:20 + NaN3で1:100
抗CD95	サンタクルス	SC-715	希釈率:PBSTで1:2000 + NaN3で1:100
アンチ-c-FLIP NF6 Ab	これらの実験ではP.クラマー教授によって提供され、またはENZOによって購入することができます	ALX-804-961-0100	希釈率:PBSTで1:10 + 1:100 NaN3
反FADD 1C4 Ab	これらの実験ではP.クラマー教授によって提供され、またはENZOによって購入することができます	アナログ・デバイセズ-AAM-212-E	希釈率:PBSTで1:10 + 1:100 NaN3
反PARP Ab	細胞シグナル伝達	9542	希釈率:PBSTで1:1000 + NaN3で1:100
APSの	カール・ロス	9592.3
β-メルカプトエタノール	カール・ロス	4227.2
ブラッドフォード溶液タンパク質アッセイ色素試薬濃縮物450ml	バイオ・ラッド	〒500-0006	製造元の指示に従って使用
CD95L	これらの実験ではP.クラマー教授によって提供され、またはENZOによって購入することができます	ALX-522-020-C005
化学発光検出器 Chem Doc XRS+	バイオ・ラッド
完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(PIC)	シグマ・アルドリッチ	ALX-522-020-C005	メーカーの指示に従って準備
DPBS (10x) w/o Ca, Mg	パンバイオテクノロジー	品番04-53500	H2Oで1:10に希釈し、冷蔵庫で保存
電気泳動バッファー	自力		10x 電気泳動バッファー:60.6 g Tris 288 g グリシン 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 希釈(使用前
グリシン	カール・ロス	3908.3
ヤギ抗マウスIgG1 HRP	サザンバイオテクノロジー	1070-05	PBSTで1:10.000の希釈+ 5%ミルク
ヤギ抗マウスIgG2b HRP	サザンバイオテクノロジー	1090-05	PBSTで1:10.000の希釈+ 5%ミルク
ヤギ抗ウサギIgG-HRP	サザンバイオテクノロジー	4030-05	PBSTで1:10.000の希釈+ 5%ミルク
インターロイキン-2ヒト(hIL-2)	メルクグループ/ロシュ	11011456001	T細胞の活性化に
KClの	カール・ロス	6781.2
KH2PO4	カール・ロス	3904.1
ローディングバッファー 4x Laemmli サンプルバッファー、10 mL	バイオ・ラッド	〒161-0747	メーカーの指示に従って準備
Luminata Forte Western HRP基板	ミリポア	WBLUFO500
溶解バッファー	自力		13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 に 960 mL H2O を添加
接着細胞用培地 DMEM F12 (1:1) w 安定グルタミン、2,438 g/L	パンバイオテクノロジー	品番04-41154	10%FCS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、0.0001%ピューロマイシンを培地に加える
初代T細胞用培地	ライフテクノロジのgibco	21875034	10%FCSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを培地に加える
粉ミルク	カール・ロス	T145.4
Na2HPO4	カール・ロス	P030.3
NaCl	カール・ロス	3957.2
PBSTの	自力		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 Copyright © 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Page 3 of 3 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage
PBST + 5% 牛乳	自力		粉乳50 g + 1 L PBST
PHAの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	R30852801	T細胞の活性化に
パワーパックHC	バイオ・ラッド
プレシジョンプラスプロテインスタンダードオールブルー	バイオ・ラッド	〒161-0373	3〜5μLで使用
プロテインAセファロースCL-4Bビーズ	ノボダイレクト/ Th.ガイヤー	GEの17-0780-01	メーカーの指示に従って調製したアフィニティ樹脂ビーズ
スクレーパー	VWRの	〒734-2602
SDSの	カール・ロス	4360.2
シェーカー	ハイドルフ
アジ化ナトリウム	カール・ロス	K305.1
テメド	カール・ロス	2367.3
トランスブロットターボミニサイズトランスファースタック	バイオ・ラッド	〒170-4270	製造元の指示に従って使用
TransBlot Turbo 5x トランスファーバッファー	バイオ・ラッド	10026938	メーカーの指示に従って準備
TransBlot Turbo Miniサイズニクロセルロースメンブレン	バイオ・ラッド	〒170-4270	製造元の指示に従って使用
トランスブロットターボ	バイオ・ラッド
トリス	ケムソルテ	8,08,51,000
トリトンX-100	カール・ロス	3051.4
Tween-20 (トゥイーン 20	パンリアック アプリケム	A4974,1000

の 抗体 名 ) の )