ノーザンブロットは、植物組織の全RNA抽出物中の特定のマイクロRNAを検出し、定量します。

要約

出典:Tirumalai, V., et al. RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、植物組織から抽出した全RNAからマイクロRNA(miRNA)を検出し定量するハイブリダイゼーション技術であるノーザンブロットを実演します。

プロトコル

1. ゲル電気泳動

1. サンプルをロードする前に、プレランを停止し、ウェルを洗浄します。
2. サンプルを98°Cで1分間加熱し、キャピラリーチップを使用してサンプルをウェルに高温でロードします。サンプルがウェルの1つの薄い層を占めるように、チップをウェルの底に挿入します。
3. すべてのサンプルの完全なロード。RNAディケードマーカーのロードを含めます。
4. ブロモフェノールブルー色素がほぼ完全に流れるまで、ゲルを80Vで泳がせます。ブロモフェノールブルーは、15%変性アクリルアミドゲル中で10 bpで泳動します。

2. エレクトロブロッティングの準備

1. N+ナイロンメンブレンをガラスプレートの寸法にカットし、メンブレンの右上隅にHBペンシルでラベルを付けます。
2. メンブレンを滅菌水の表面にそっと置き、ラベルの付いた面を水面に向けています。メンブレンを15分間予備浸します。
3. あぶらとり紙Iを4枚、ファイバーパッドの寸法にカットします。
4. カセットの灰色の面を下にして、ジェルサンドイッチをきれいなトレイに置き、ジェルサンドイッチを準備します。
5. ファイバーパッドを事前に濡らし、カセットの上に置きます。気泡を取り除きます。
6. あぶらとり紙1枚を1x TBEであらかじめ濡らし、ファイバーパッドの上に置きます。プラスチックピペットを紙の上で転がして気泡を取り除きます。あらかじめ濡らしたあぶらとり紙をもう一枚置き、気泡を取り除きます。
7. ランニングカセットからゲルを慎重に取り出し、最初にロードされたRNAサンプルが右側にくるようにサンドイッチセットアップの上に置きます。
8. あらかじめ浸したメンブレンを1x TBEに静かに浸し、ラベルの付いた面を下にしてゲルの上に置きます。気泡を取り除くためにロールアウトします。
9. あぶらとり紙を浸し、メンブレンの上に置き、気泡を取り除きます。別のあぶらとり紙を浸し、サンドイッチのセットアップの上に置き、気泡を取り除きます。
10. セットアップの上にプレウェットファイバーパッドを置き、カセットをしっかりと閉じてサンドイッチを完成させます。
11. トランスブロットカセットをモジュールにセットし、1x TBE、pH 8.2をブロッティングマークまで充填します。
12. 10 Vで4°Cで一晩転送します。
13. 転写後、湿らせたメンブレンを紙シートに置き、すぐに254 nmのUV光(120,000 μジュール/cm²)を照射してRNAをメンブレンに架橋します。架橋ブロットは、さらなるハイブリダイゼーションのために4°Cで保存することができます。

3. 放射性標識プローブの準備

1. 検出するsmall RNAと完全に相補的なプローブを設計します。
2. 表32に示されているレシピに従ってコンポーネントを組み合わせることにより、5'端にƳP1ATP(BRITから取得)を使用してプローブにラベルを付けます。
3. 上記の反応混合物を37°Cで30分間インキュベートします。
4. メーカーのプロトコルに従って、Sephadex G-25カラムを使用して、標識されていないƳP32ATPをプローブから分離します。

4.ブロットのハイブリダイゼーション

1. 交差結合ブロットを、RNA側が上を向くようにして、ハイブリダイゼーションボトル内に置きます。
2. 超高感度ハイブリダイゼーションバッファーを激しく混合し、10 mLを加え、35°Cに維持したハイブリダイゼーションオーブン内でブロットを回転させてインキュベートします。
3. プレハイブリダイゼーションを20分間行います。
4. ボトルをオーブンから取り出し、標識されたプローブをハイブリダイゼーションバッファーに静かに加えます。
5. ブロットを35°Cでハイブリダイズし、12時間回転させます。
6. ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション溶液を15 mLチューブに慎重に移します。この溶液は、再利用するまで4°Cで保存できます。
7. ブロットを2分間すばやく洗浄し、2x SSCバッファーと0.5%SDSを添加して余分なハイブリダイゼーション溶液を除去します。解決策を破棄します。
8. ブロットを2x SSCバッファーと0.5% SDSで35°Cでインキュベートし、30分間回転させます。
9. ブロットを0.5倍SSCバッファーと0.5%SDSで35°Cで再度洗浄し、30分間回転させます。
10. ブロットをハイブリダイゼーションカバー内に置き、余分なバッファーを取り除き、密封します。
11. カセット内の放射線フリー蛍光体イメージャースクリーンに一晩さらします。
12. 生体分子イメージャーを使用してハイブリダイゼーションシグナルを検出し、適切なソフトウェアを使用して結果を分析します。

表1:レシピの表

バッファーと溶液	レシピ	コメント
10 X TBE	0.89M トリスバッファ	酢酸を使用してpHを8.2に設定する必要があります
	0.89Mホウ酸
	30mM EDTAの
ゲルミックス	15% アクリルアミド-ビスアクリルアミドゾル、19:1	ゲルミックスには尿素結晶が含まれていてはなりません
	8M尿素
	1X TBEの
ゲルローディング染料	0.05 %(w/v) ブロモフェノールブルー	脱イオンホルムアミドの取り扱いには注意が必要です
	0.05 %(w/v) キシレンキシヤノール
	100%脱イオン-ホルムアミド
プローブのラベリング	PNKバッファー(10X、2 μL)	この混合物には放射性分子が含まれています。この手順は、放射線研究所内の訓練を受けた職員が実行する必要があります
	PNK酵素(1 μL)
	オリゴ (100 μM, 0.1 μL)
	ƳP32 ATP (4 μL)
ウォッシュバッファ - I	2X SSC
	0.5% (w/v) 安全データシート
ウォッシュバッファ - II	0.5X SSC
	0.5% (w/v) 安全データシート
ストリッピングバッファ - I	0.5X SSC
	0.1% (w/v) SDS (英語)
ストリッピングバッファ - II	0.1X SSC
	0.1% (w/v) SDS (英語)

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
40%アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液	シグマ	A9926	ケミカル
過硫酸アンモニウム(APS)	バイオラッド	1610700	ケミカル
吸い取り紙	Whatmanあぶらとり紙I	1001-125	試験
ブロモフェノールブルー	シグマ	B5525-5Gの	ケミカル
キャピラリーローディングのヒント	バイオラッド	2239915	プラスチック製品
脱イオンホルムアミド	アンビオン	AM9342	ケミカル
ヒーティングブロック	エッペンドルフ	5350	デバイス
ハイボンドN +ナイロンメンブレン	GEの	RPN203B	試験
ハイブリダイゼーションボトル	シグマ	Z374792-1EA	プラスチック製品
ハイブリダイゼーションオーブン	サーモサイエンティフィック	1211V79	デバイス
N、N、N'、N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)	シグマ	T7024-25ミリリットル	ケミカル
フォスファーイメージャ	GE-タイフーンスキャナー	29187194	デバイス
PhosphorImagerスクリーンとカセット	GEヘルスケア	GE28-9564から75	デバイス
ピペット	ギルソン、モデル:P20およびP10	FA10002M, FA10003M	プラスチック製品
プラスチックピペット	隼	357550	プラスチック製品
ポリアクリルアミドゲル装置	バイオラッド	1658003EDU	デバイス
セファデックスG-25カラム	GEヘルスケア	27532501	デバイス
Speed Vacコンセントレーター	サーモサイエンティフィック	20-548-130	デバイス
スピンウィン	ターソン	1010	デバイス
T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)	NEBの	M0201S(英語)	試験
トランスブロット装置	バイオラッド	1703946	デバイス
ULTRAHybハイブリダイゼーションバッファー	アンビオン	AM8670	試験
尿素	フィッシャーサイエンティフィック	15985	ケミカル
UVクロスリンカー	UVPの	CL-1000L	デバイス
渦動	ターソン	3020	デバイス
ウォーターバス	ネオラボ	D-8810	デバイス
キシレンシアノール	シグマ	X4126-10G	試験

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