アクチンと微小管の結合ダイナミクスを可視化するTIRF顕微鏡法

要約

出典: Henty-Ridilla, J.L., Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp.(2022年度)

このビデオでは、アクチンと微小管の重合ダイナミクスを視覚化するための全反射顕微鏡ベースの手法であるTIRFについて説明しています。この手法により、細胞のクロストークを理解するために不可欠な、アクチンと微小管の結合ダイナミクスをリアルタイムで高解像度でイメージングできます。

プロトコル

1. カバースリップの洗浄

>注:Smith et al., 2013によると、洗濯(24 mm x 60 mm、#1.5)カバースリップ。

1. プラスチック製のスライドメーラーコンテナにカバースリップを配置します。
2. カバーガラスを以下の溶液に順次沈め、30〜60分間超音波処理し、各溶液の間にddH₂Oを10回すすいでください:ddH₂Oを1滴の食器用洗剤で;0.1M KOHで。カバースリップは100%エタノールで最大6か月間保管してください.
   手記： 手袋をしていない指でガラス面に触れないでください。代わりに鉗子を使用してください。

2. mPEGおよびビオチン-PEG-シランで洗浄された(24 mm x 60 mm、#1.5)カバースリップ

>注:このプロトコルは、特にビオチン-ストレプトアビジンシステムを使用して、TIRFイメージングプレーン内にアクチンと微小管を配置します。他のコーティングおよびシステム(例えば、抗体、ポリ−L−リジン、NEMミオシンなど)を使用してもよい。

1. PEG-シランおよびビオチン-PEG-シラン粉末のアリコートを解凍します。
2. 使用直前に、PEG粉末を80%エタノール(pH 2.0)に溶解して、10 mg/mL mPEG-シランと2-4 mg/mLビオチン-PEG-シランのコーティング原液を生成します><。 手記：PEG粉末はしばしば溶解しているように見えますが、顕微鏡レベルではないかもしれません。適切な再懸濁には、一定のピペッティングで1~2分かかります。ユーザーは、粉末の溶解が現れた後、さらに10回ピペットすることをお勧めします.
   注意：80%エタノール(pH 2.0)を製造するときは、濃縮されたHClから皮膚を保護するために手袋を着用してください。
3. 鉗子を使用して、エタノール保管からきれいな(24 mm x 60 mm、#1.5)カバースリップを取り出します。窒素ガスで乾燥させ、清潔なシャーレに保管してください。
4. 100 μL のコーティング溶液: 80% エタノール (pH 2.0) (pH 2.0) に 2 mg/mL の mPEG-シラン (MW 2,000) と 0.04 mg/mL のビオチン-PEG-シラン (MW 3,400) を混合したコーティング液でカバースリップをコーティングします< br /> 手記：スパースコーティング(推奨)には、2 mg/mL mPEG-シランと0.04 mg/mLのビオチン-PEG-シランを使用します。緻密なコーティングには、2 mg/mL mPEG-シラン、4 mg/mL ビオチン-PEG-シランを使用します。
5. カバースリップを70°Cで少なくとも18時間、または使用するまでインキュベートします.
   手記： コーティングされたカバーガラスは、70°Cで2週間以上保存すると劣化します。

3. イメージングフローチャンバーの組み立て

1. 両面テープを12枚24mmの長さにカットします。テープの裏面の片側をはがし、清潔なイメージングチャンバーにある6つの溝に隣接するテープを固定します。.
   手記：テープは適切に組み立てるために平らでなければならず、そうしないとイメージングチャンバーが漏れます。テープの裏地を慎重に取り外して、ぶつからないようにします。テープで固定されたチャンバーを清潔な表面にスライドさせて、テープチャンバーの接触を滑らかにすることをお勧めします。
2. テープの裏地の2枚目をはがして、各チャンバーの溝に沿ってテープの粘着面を露出させます。チャンバーテープ面を上にして清潔な面に置きます。
3. エポキシ樹脂と硬化剤溶液を1:1(または製造元の指示に従って)小さな計量ボートで混合します。
4. P1000チップを使用して、各イメージングチャンバーの溝の端にあるテープストリップの間に混合エポキシを一滴垂らします(赤い矢印;図 1A)。チャンバーテープ/エポキシ面を上にして清潔な面に置きます。
5. コーティングされたカバーガラスを70°Cインキュベーターから取り外します。カバーガラスのコーティング面と非コーティング面をddH₂Oで6回すすぎ、ろ過した窒素ガスで乾燥させた後、カバーガラスのコーティング面をテープに向けてイメージングチャンバーに貼り付けます。
6. P200またはP1000ピペットチップを使用してテープとガラスのインターフェースに圧力をかけ、テープとカバースリップの間に良好なシールを確保します><。 手記：適切なシールにより、両面テープは半透明になります。十分なテープチャンバーの接点がないイメージングチャンバーは漏れます。
7. 組み立てたチャンバーを室温で少なくとも5〜10分間インキュベートし、使用前にエポキシがチャンバーウェルを完全にシールできるようにします。灌流チャンバーは、組み立てから12-18時間以内に期限切れになります.
   手記：テープの配置と使用する両面テープの厚さにもよりますが、組み立てられたチャンバーの最終容量は20〜50μLになります。

4. 灌流チャンバーのコンディショニング

1. 灌流ポンプ(速度を500 μL/minに設定)を使用して、灌流チャンバー内のコンディショニング溶液を次のように順次交換します。
   1. 1% BSAを50 μL流して、イメージングチャンバーをプライミングします。ルアーロックフィッティングリザーバーから余分なバッファーを取り外します。
   2. 0.005 mg/mL ストレプトアビジン 50 μL を流します。室温で1〜2分間インキュベートします。リザーバーから余分なバッファーを取り除きます。
   3. 1% BSAを50 μL流して、非特異的結合をブロックします。10〜30秒間インキュベートします。リザーバーから余分なバッファーを取り除きます。
   4. 50 μL の温かい (37 °C) 1x TIRF バッファー (1x BRB80、50 mM KCl、10 mM DTT、40 mM グルコース、0.25% (v/v) メチルセルロース (4,000 cp)) の 50 μL を流します< br /> 手記：リザーバーから余分なバッファーを取り出さないでください。これにより、システムに気泡が入り込む可能性のあるチャンバーの乾燥を防ぎます。
   5. オプション:1x TIRFバッファーで希釈した安定化および50%ビオチン化微小管シード50μLを流します。
      手記： 適切な希釈は経験的に決定され、バッチ間の変動を封じ込める必要があります。視野ごとに10〜30個の種子を生成する希釈は、この設定でうまく機能します。

5. 顕微鏡の準備

>注:動的アクチンフィラメントと微小管を含む生化学反応は、120-150 mWの固体レーザー、温度補正された63倍油浸TIRF対物レンズ、およびEMCCDカメラを備えた倒立型全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用して視覚化/実行されます。この例のタンパク質は、488 nm(微小管)と647 nm(アクチン)の波長で可視化されています。

1. ステージ/対物ヒーター装置を、最初の生化学反応をイメージングする少なくとも30分前に35〜37°Cに維持するように設定します。
2. 画像取得パラメータを次のように設定します。
   1. 集録間隔を5秒ごとに15〜20分設定します。
   2. 488 および 647 レーザーの露光を 50 〜 100 ミリ秒に 5% 〜 10% の出力で設定します。顕微鏡に適切なTIRF角度を設定します.
      手記：顕微鏡のセットアップに関係なく、レーザー出力、露光、TIRF角度を設定する最も簡単な方法は、いずれかのポリマーのみの画像を調整することです(以下の5.2.2.1および5.2.2.2を参照)。ユーザーは、検出を可能にする最も低いレーザー出力と露出設定を使用することを強くお勧めします。
      1. 重合反応(図1C)を調整してアクチンフィラメントの集合を開始し、647 nmで画像を取得します。適切な調整を行います。
      2. 2番目のコンディショニング灌流ウェルで重合反応を調整して、微小管の集合を開始し(図1C)、488 nmで可視化します。適切な調整を行います。

6. タンパク質反応ミックスの調製

1. 蛍光標識チューブリンの原液を調製します。
   1. Abs₂₈₀の分光光度法により、自家製の非標識チューブリンの濃度を次のように測定します。
      1. GTPが欠けている1xBRB80のブランク分光光度計。
      2. 決定された吸光係数 115,000 ^{M-1 cm-1} と次の式を使用して、チューブリンの濃度を計算します:
         
   2. 市販の凍結乾燥リジン標識488-チューブリンを、GTPを含まない1x BRB80を20 μLで10 μM(1 mg/mL; 100%標識)に再懸濁します。
   3. 100 μM の非標識リサイクルチューブリンの 7.2 μL アリコートを氷上で解凍します.
      手記：リサイクルチューブリンは、凍結タンパク質ストックで形成された重合性の低い二量体を除去するため、in vitroでの微小管の組み立てを成功させるために重要です。
   4. 3 μL の 10 μM 488-チューブリンと 7.2 μL の 100 μM 非標識チューブリンを、使用の 15 分以内に組み合わせます。
2. 蛍光標識アクチンの原液を調製します。
   1. 自家製タンパク質の場合、次のように、分光光度法AbsAbs₂₉₀およびAbs₆₅₀を使用してアクチンの濃度とパーセントラベルを決定します。
      1. Gバッファ付きブランク分光光度計。
      2. 決定された吸光係数 25,974 ^{M-1 cm-1} と次の式を使用して、非標識アクチンの濃度を計算します:
         
      3. 非標識アクチンの吸光係数、0.03の蛍光補正係数、および次の式を使用して、リジン標識Alexa-647-アクチンの濃度を計算します:
         
      4. Alexa-647 の決定された ε 239,000 ^{M-1 cm-1} を使用して、Alexa-647-actin のラベルの割合を次のように計算します
         
   2. 3 μM 100%標識ビオチンアクチン(リジン残基に標識)の2 μLアリコート1つを解凍します。18 μLのGバッファーを加えて10倍に希釈します。
   3. 希釈したビオチン化アクチン3μLと、適切な量の非標識アクチンおよび標識アクチン(上記)を組み合わせ、最終混合物が10%〜30%の蛍光標識を持つ総アクチン12.5 μMになるようにします
      手記： 蛍光アクチンモノマー(最終)が30%を超えると、フィラメントが背景から識別しにくくなり、イメージングの分解能が低下する可能性があります。
3. 反応ミックスを調製します(図1C)。
   1. イメージングの15分前までに、12.5 μMアクチンミックスストックストック(6.2.3)2 μLとチューブリンストックミックス(6.1.4)を組み合わせて、細胞骨格ミックス(チューブA)を調製します。使用するまで氷上で保管してください。
   2. 2x TIRFバッファー、抗漂白剤、ヌクレオチド、バッファー、アクセサリータンパク質など、他のすべての実験成分とタンパク質を組み合わせて、タンパク質反応ミックス(チューブB)を調製します。例を図 1C.
      に示します。 手記： 最終希釈により、推定生理学的範囲内にATP、GTP、およびイオン強度を含む1x TIRFバッファーが得られます。
4. チューブAとチューブBを別々に37°Cで30〜60秒間インキュベートします。反応を開始するには、チューブBの内容物を混合し、チューブA(下図)に加えます。

>7. 画像アクチンと微小管のダイナミクス

1. コンディショニング灌流ウェル(図1B;上記ステップ4)。
2. チューブB(反応ミックス)の内容物をチューブA(細胞骨格ミックス)に添加することにより、アクチンと微小管の集合を同時に開始します(図1C)。
3. 1x TIRFバッファーに15 μM遊離チューブリン、1 mM GTP、0.5 μMアクチンモノマーを添加し、適切な量のバッファーコントロールを添加した反応液50 μLを流します。
4. 顕微鏡ソフトウェアを使用してタイムラプス動画を録画し、5秒ごとに15〜20分間取得します.
   手記：アクチンと微小管のダイナミクスの開始は、2〜5分以内に起こります(図2)。遅延が長い場合は、反応混合物中のタンパク質の温度制御に問題があるか、濃度に関連する問題があることを示しています。
5. 新しい灌流ウェルをコンディショニングし(ステップ4)、バッファー容量を目的の調節タンパク質(タウなど)およびバッファーコントロール(図1C)に置き換えます。ステップ7(上記)で概説したように取得し、創発性アクチン-微小管機能の調節タンパク質を評価します。

結果

図 1.実験的な概略図:フローチャンバーの組み立てから画像取得まで。(A)イメージングチャンバーアセンブリ。上から下へ:IBIDIイメージングチャンバーは、灌流ウェルに沿ってテープで固定されています(矢印で示しています)。テープの裏地の2番目の(白い)層(画像ではユーザーの向きをわかりやすくするために残されています)が取り除かれ、灌流チャンバーの端にエポキシが塗布されます(矢印)。注:エポキシ樹脂をどこに設置するかをユーザーに分かりやすくするために、この画像では白い裏地をオンのままにしています。洗浄およびコーティングされたカバースリップは、コーティング面が灌流ウェルの内側を向くようにイメージングチャンバーに取り付けられます。(B)ビオチン-ストレプトアビジン結合のためのイメージングチャンバーのコンディショニング手順を示すフローチャート。 (C)動的微小管および...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1%BSA(w / v)	フィッシャーサイエンティフィック	BP1600-100	この目的(TIRFチャンバーのブロッキング)のために、BSAをddH20に再懸濁し、0.22μmフィルターでろ過します。
1× BRB80	ホームメード		80 mM PIPES、1 mM MgCl2、1 mM EGTA、pH 6.8、KOH
80 mM PIPES、1 mM MgCl2、1 mM EGTA、pH 6.8、KOH	Sigma Aldrich Inc、ミズーリ州セントルイス	G2133-50KU	カタラーゼと組み合わせて、アリコートを使用し、使用まで-80°Cで保存
100 μM チューブリン	Cytoskeleton Inc、コロラド州デンバー	T240	自家製チューブリンは、重合性のないチューブリンを除去するために使用前にリサイクルされるべきである(Hyman et al. (1992)29;Li and Moore (2020)30 )。市販のチューブリンは、リサイクルするには希釈すぎることがよくありますが、製造元の指示に従って再懸濁し、使用前に超遠心分離(278,000 × g)で60分間事前に透明化すれば、十分に機能します。
100 mM ATP	Gold Biotechnology Inc、ミズーリ州オリベット	A-08	ddH20(pH 7.5)に再懸濁し、フィルター滅菌しました。
100 mM GTPの	フィッシャーサイエンティフィック	AC226250010	1× BRB80(pH 6.8)に再懸濁し、フィルター滅菌しました。
120-150 mW固体レーザー	ライカマイクロシステムズ	11889151; 11889148
2 mg / mLカタラーゼ	Sigma Aldrich Inc、ミズーリ州セントルイス	C40-100	グルコースオキシダーゼと組み合わせて、アリコートし、使用するまで-80°Cで保存
2× TIRFバッファ	ホームマッド		2× BRB80、100 mM KCl、20 mM DTT、80 mMグルコース、0.5%(v / v)メチルセルロース(4,000 cp);注:1 μL の 0.1M GTP と 1 μL の 0.1M ATP を別々に TIRF 反応に添加すると、凍結融解サイクルが繰り返されるのを防ぐことができます。
24 × 60 mm、#1.5カバーガラス	フィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム	22-266882	カバーガラスは使用前に広範囲に洗浄する必要があります(Smith et al.(2014)22)。
37°Cヒートブロック
37°Cウォーターバス
5 mg/mL ストレプトアビジン (600x ストック)	Avantor、フィラデルフィア、ペンシルバニア州	RLS000-01	Tris-HCl(pH 8.8)に再懸濁し、使用日当日にアリコートをHEKバッファーで1×に希釈してください
5分 エポキシ樹脂と硬化剤	ロックタイト、ロッキーヒル、コネチカット州	1365736	樹脂と硬化剤を混ぜ合わせた硬化剤は、硬化するまでに最大30分かかる場合があります。
50% ビオチン化 GpCpp 微小管シード	サイトスケルトン株式会社;ホームメード	T333Pの	(オプション)GppCppまたはタキソール安定化微小管種子は、微小管の重合をより効率的に媒介することができます。タキソールとGppCppは、微小管の格子構造や、特定の調節タンパク質が微小管の安定化部分に結合する能力に影響を与える可能性のあるさまざまな方法で微小管を安定化します。多様な種類の微小管種子を作製する方法は、Hyman et al. (1992)に概説されています。
70°Cインキュベーター
アクチンミックスストック	自家製、このプロトコル		標識アクチン(蛍光およびビオチン化)と非標識アクチンからなる12.5 μMアクチンミックスを最大6回の反応に使用できます。最終的なTIRF反応では、2 μLのストックを使用します。各反応で使用されるアクチンの最終濃度は0.5 μM(10% Alexa-647、0.09% ビオチン標識済み)です。
適切なバッファー制御	ホームメード		評価対象のすべてのタンパク質由来のバッファーの組み合わせ
ビオチン-PEG-シラン (MW 3,400)	レイサンバイオ株式会社	ビオチン-PEG-SIL-3400	2〜5 mgのアリコートに分注し、窒素で埋め戻し、閉じてパラフィルムで固定し、使用まで乾燥剤で-20°Cで保存します
ビオチン化アクチン	サイトスケルトン株式会社;ホームメード	AB07	ビオチンアクチンは、リジン残基に標識することで作られるため、少なくとも100%標識されていると想定されますが、ロットや調製物によって異なります。最適なビオチン化アクチン濃度は、特定の用途/実験デザインについて経験的に決定する必要があります。高濃度では、より効率的なトラッキングが可能になりますが、重合や調節タンパク質との相互作用が妨げられる可能性があります。ここでは、ごく一部(0.09%または900 pM)のビオチン化アクチンが最終的なTIRF反応に存在します。
食器用洗剤	ドーン、プロクター・アンド・ギャンブル、オハイオ州シンシナティ		理由は不明ですが、ブルーバージョンは他の利用可能な色よりも効率的にカバースリップをクリーニングします。
ドライアイス
蛍光標識アクチン	サイトスケルトン株式会社;ホームメード	AR05	自家製の蛍光標識アクチンは、-20°Cで50%グリセロールを添加したGバッファーに保存されます(Spudich et al.(1971)47;Liu et al. (2022)48 )。蛍光標識アクチンをGバッファーに対して透析し、使用前に278,000 × gの超遠心分離で60分間プレクリアします。
蛍光標識チューブリン	サイトスケルトン株式会社	TL488M、TLA590M、TL670M	20 μL 1× BRB80(最終濃度10 μM)に再懸濁し、超遠心分離(278,000 × g)で60分間事前に透明化してから使用してください。
Gバッファ	ホームメード		3 mM Tris-HCl (pH 8.0)、0.2 mM CaCl2、0.5 mM DTT、0.2 mM ATP
HEKバッファ	ホームメード		20 mM HEPES (pH 7.5)、1 mM EDTA (pH 8.0)、50 mM KCl
氷
アイスバケツ
イメージングチャンバー	IBIDI、ウィスコンシン州フィッチバーグ	80666	底部のないチャンバーを注文して、さまざまなカバースリップコーティングを利用します
iXon Life 897EMCCDカメラ	アンドール、ベルファスト、北アイルランド	8114137
LASX Premium顕微鏡ソフトウェア	ライカマイクロシステムズ	8114137
メチルセルロース (4,000 cp)	シグマ・アルドリッチ	M0512
TIRFモジュールを搭載した顕微鏡ベース	Leica Microsystems、ウェッツラー、ドイツ	11889146
mPEG-シラン (MW 2,000)

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