生細胞における受容体-リガンド相互作用を可視化するための格子ライトシート顕微鏡法

要約

出典:Rosenberg, J., et al. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (2020).

このビデオでは、生きたT細胞と抗原提示細胞との間の相互作用を可視化するための格子ライトシート顕微鏡法について説明します。この方法では、相互作用する細胞ペアに極薄の格子ライトシートを集束させて一連の2次元画像を取得し、それらを組み合わせて高解像度の4次元画像を取得し、細胞間相互作用の時空間ダイナミクスを明らかにします。

プロトコル

1. LLSMデイリーアライメントの実施

>注:(重要)このアライメントプロトコルは、使用されるLLSM機器に基づいています(資料の表を参照)。各LLSMは異なる場合があり、特に自家製のものとは異なるアライメント戦略が必要です。適切なルーチンアライメントを行い、セクション2に進みます。

1. 10 mL の水と 30 μL のフルオレセイン (1 mg/mL ストック) を LLSM 浴 (~10 mL 容量) に加え、Image (Home) を押して対物レンズを画像位置に移動し、1 つのベッセル レーザー ビーム パターンを確認します。ガイドと事前に設定された関心領域(ROI)を使用してレーザービームを位置合わせし、ビームを全方向にバランスの取れた細いパターンにします。
   1. ビームは、ファインダーカメラにも焦点が合っているように見えます。2つのミラーチルトアジャスター、トップマイクロメーター、フォーカス、および放出対物レンズカラーを使用して調整します。図 1 A と B で、正しく位置合わせされたビームを参照してください。
2. 浴と対物レンズを少なくとも200mLの水で洗浄し、フルオレセインを完全に除去します。
3. イメージング培地中の物理的点像分布機能(PSF)のためのイメージング培地中の画像標準蛍光ビーズ(ポリ-L-リジンを含む5 mmカバースリップにビーズを接着することによって調製、材料表を参照;これは事前に調製して再利用することができます)
   注:後で処理するためにビューに表示されるビーズは1つだけであるため、ビューアで単独で存在するビーズ、または簡単にトリミングして1つのビーズを取得できるビーズを見つけてみてください。
   1. 「X Galvo range」ボックスでディザを 3 に設定して、ディザをオンにします。[ライブ] を押して、現在のフィールドを表示します。Z方向に沿って移動して、カバースリップとビーズを見つけます。Z方向に移動してビードの中心を見つけ、Stopを押してレーザーを一時停止します。3Dにチェックを入れ、Centerを押してからExecuteを押します。これにより、データが収集されます。
   2. チルトミラー、対物レンズカラー、フォーカスマイクロメーターを手動で調整して、最高のグレー値にしてから、必要に応じて調整して、対物スキャン、zガルボ、z +対物レンズ(totPSF)、およびサンプルスキャン(samplePSF)キャプチャモードの適切なパターンを取得します。適切に調整された最大強度投影 (MIP) については、図 1 C-F を参照してください。
      手記： さまざまなキャプチャモード(対物スキャン、zガルボ、z +対物レンズ、サンプルスキャン)により、ライトシートがサンプル内を移動する方法が変わります。アライメントには、すべてのスキャンモードを使用する必要があります。
   3. サンプルスキャンは、実験中にデータがどのように収集されるかを示しています。サンプル スキャン モードで [実行] を押して、デスキューとデコンボリューションのためにサンプル PSF を収集します。レーザーを3つのカラーモード(488、560、647)に変更し、もう一度実行を押します。
      手記：LLSM画像は斜め(57.2°)にあるため、「サンプルスキャン」モードでキャプチャされた画像はこの角度で収集され、したがって「歪んでいる」ことになります。傾き補正は、この角度を補正し、画像を真の Z スタックに「再整列」するプロセスです。これらのデータは、イメージングメディアと、実験中にイメージングされるすべてのチャネルで収集する必要があります。これを適切に収集しないと、データは適切に歪められません。同様に、培地が37°C(または希望する実験温度)に温められていることを確認してください。

2. LLSMによるセルの設定

1. 直径5 mmの円形カバーガラスに100,000個の抗原提示細胞(APC)(50 μL)を加え、10分間静置します。
2. サンプルホルダーにグリースを塗り、セル側を上にしてカバースリップを追加します。カバーガラスの裏側にイメージングメディアを一滴追加して、気泡を避けてから浴槽に入れます。サンプルホルダーをピエゾにねじ込み、Image(Home)を押します。
3. LLSMとイメージングソフトウェア(材料の表を参照)が正しく機能していることを確認するために、イメージングするAPCを見つけます。
   手記： ディザを3に設定した2色に対して、60Zステップと10msの露光で0.4μmステップの画像を作成し、~200nmのXYと400nmのZ解像度で3D画像のフレームあたり1.54秒になります。これらの設定は、セルサイズ、目的のz分解能、および使用する蛍光標識技術からのシグナルの強度に基づいて調整する必要がある場合があります。レーザー出力の使用量は、使用される蛍光標識技術によっても異なります。
   1. [ライブ]を押して、現在の画像を表示します。Z に沿って移動して、カバースリップとセルを見つけます。
   2. Z 方向に移動して APC の中心を見つけ、[停止] を押してレーザーを一時停止します。3Dを確認して必要な設定を入力し、Centerを押してからExecuteを押します。これにより、データが収集されます。
4. ステージをロード位置まで下げ、イメージング培地中の50 μLのT細胞(100,000細胞)をカバーガラスに直接滴下します。ピペットチップの端に液滴を形成してから、チップをバス液に触れるのが最善です。「画像(戻る)」をクリックしてステージを戻します。
5. イメージングを開始します。希望のスタックサイズとタイムラプスの長さを必ず設定してください。たとえば、0.4 μm のステップ サイズで 60 個の Z スタックを画像化し、500 個のフレームを入力します。(通常)光退色を避けるために、500フレームに達する前に録画を停止します。ライブモードを使用してセルペアを検索し、準備ができて必要な設定を入力したら、Executeを押してデータを収集します。例については、図 2 を参照してください。

結果

図1:LLSMアライメント (A)LLSMイメージング実験に必要なビームパターン。(B)ビームアライメントプロセスのスクリーンショット。左側には、狭く焦点を絞ったビームを示すフォーカスウィンドウがあります。右上には、ビームがウィンドウの中央に配置されていることを示すグラフがあります。右下にはFinderカメラがあり、これも細い集束ビームである必要があります。(C)対物スキャンによるビーズの最大強度投影(MIP) (D)zガルボスキャンによるビーズの最大強度投影(MIP) (E)z+対物スキャンによるビーズの最大強度投影(MIP) (F)サンプルスキャンによるビーズの最大強度投影(MIP)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5mm丸型カバースリップ	世界の精密機器	502040	イメージング用
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain 抗体	バイオレジェンド	109215	イメージング用
フルオレセインナトリウム塩	シグマ・アルドリッチ	F6377	顕微鏡のアライメント用
FluoSpheres カルボン酸修飾マイクロスフェア	サーモフィッシャーサイエンティフィック	F8810	顕微鏡のアライメント用
イマリス	ビットプレーン	該当なし	追跡ソフトウェア;追跡ソフトウェアの他のオプションには、AmiraまたはTrackmate(フィジー)が含まれます。
ラティスライトシート顕微鏡	3i	該当なし	使用した顕微鏡
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red (ライボビッツ L-15 ミディアム、フェノールレッド不	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21083027	イメージング用
スライドブック	3i	該当なし	LLSMイメージングソフトウェア
ポリ-L-リジン	フェニックス研究製品	8920-100ミリリットル	イメージング用