細胞膜上のナノロッドの拡散ダイナミクスを可視化するための暗視野顕微鏡法

要約

出典:Ge, F., et al. 単一ナノ粒子暗視野顕微鏡を用いた細胞膜上の金ナノロッドの拡散ダイナミクスの可視化。J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオでは、暗視野顕微鏡(DFM)技術と単一粒子追跡(SPT)分析を組み合わせて、プラズモニック金ナノロッドと目的の細胞株の細胞膜との相互作用を監視する方法について説明します。DFMとSPTを組み合わせた分析により、細胞膜を通るナノロッドの動きを高い時空間分解能で可視化できます。

プロトコル

1. 顕微鏡スライドの準備

>注:SPT実験では、高活性の第3世代から第10世代のU87 MG細胞が使用されます。

1. ピラニア溶液で洗浄済みの22mm×22mmのカバースリップをエタノール(99.9%)に浸して滅菌します。
2. 鉗子を使用してエタノール溶液からカバースリップを取り出し(ステップ1.1)、炎の上でエタノールを燃焼させて滅菌します。すべてのエタノールを燃焼させたら、2 mLの細胞培地(フェノールレッドなし)を充填したプラスチック製の細胞培養皿(35 x 10 mm)にカバーガラスを置きます。
3. カバーガラスに細胞懸濁液50μLを加え、皿を前後左右にゆっくりと押して、細胞を均等に分散させます。加湿された雰囲気に置きます。
4. カバーガラス上のU87 MG細胞が20%〜40%のコンフルエント度(~12時間)に達したら、20 μLのCTAB-AuNR(臭化セチルトリメチルアンモニウムアンモニウム分子を保護剤として合成した金ナノロッド、138 pM)を皿に添加して分散させます。加湿雰囲気で5分間インキュベートします。
5. ステップ1.4のディッシュから培地100μL(フェノールレッドなし)を、ピラニア溶液で予備洗浄した溝付きスライドガラス(図1)の溝に加えます。
6. カバースリップを皿から取り出し、顕微鏡スライドガラスの溝の上部で反転させます(図1)。マニキュアで密封し、乾燥させてからステージに置き、SPT実験を行います。

2. 暗視野顕微鏡による単粒子追跡実験の実施(図1)。

1. 油に浸した暗視野コンデンサー(開口数(NA)1.43-1.20)にオイルを一滴垂らし、ノブを回してコンデンサーをスライドガラスに接触させます。
2. カバーガラスの上部にオイルを一滴垂らし、フォーカシングノブを回して、60倍オイル浸対物レンズ(NA 0.7〜1.25)をオイルに接触させます。
3. 光源をオンにし、フォーカスノブを少し回してイメージング面に焦点を合わせます.
   手記：視野では、背景は黒く、セルは明るく、CTAB-AuNR(アスペクト比~2:1、図2)は小さな色(赤、黄、または緑)の散乱スポットです。
4. カラーCMOSカメラでサンプルの散乱光を捕捉します。ソフトウェアの「カメラアイコン」をクリックして、TIFF形式を記録およびエクスポートし、画像を保存します。

>3. データ取得

1. 1 つの長期軌跡を抽出
   1. 図3の説明に従って操作し、時系列暗視野画像を「RGBカラー」モードから「8ビット」モードに変換します。画像 J で、[画像 |タイプ |8 ビット。コントラストを調整するには、[イメージ] |調整 |明るさ |コントラスト。
   2. ターゲットパーティクルを選択し、「Ctrl+X」で背景をボックス化して削除することで、時系列背景を切り取ります。
   3. 「Plugins |パーティクルトラッカークラシック |パーティクルトラッカー」。
   4. [半径] を 6 に、[カットオフ] を 0 に、[パーセンタイル] を 0.01%.
      に設定します。 手記：パーティクルを検出するには、プレビューを使用して上記の 3 つのパラメーターを調整します。半径がターゲット粒子よりわずかに大きく、最小の粒子間分離よりも小さいことを確認します。パーセンタイルは、候補粒子となる強度分布の下限です。
   5. Link Rangeを5に、Displacementを10.
      に設定します 手記：連続する隣接するフレーム間でパーティクルをリンクするには、上記の 2 つのパラメータを調整します。ディスプレイスメントは、パーティクルが 2 つの連続するフレーム間を移動できる最大ピクセル数であり、リンク範囲は、対応する最適な一致を決定する際に考慮する連続フレームの数です。
   6. 「OK」をクリックしてParticleTrackerの結果ウィンドウを開き、結果を確認します。
   7. 「Visualize All Trajectories」をクリックして、生成された軌跡を検査します。
   8. ソフトウェアで生成された軌道がAuNRの移動軌跡と一致しない場合は、上部の[Relink Particles]メニューをクリックして、検出された粒子を異なるリンク範囲とパーセンタイルパラメータで再リンクします。
   9. ソフトウェアが生成した軌跡とAuNRの移動軌跡が一致した場合、「Save Full Report」をクリックして結果を保存します
      注:画像Jを使用して単一の長期軌跡を抽出する例を図4に示します。

結果

図1:暗視野顕微鏡の光路、顕微鏡スライドの準備、およびAuNRの極角(θ)を計算するためのデュアルチャネル差分法の概略図。 画像のスケールバーは2μmです。

図2:CTAB-AuNRの特性評価。 (A)CTAB@AuNRsのTEM像。(B)CTAB@AuNRsのLSPRスペクトル。(C)単一粒子強度の分布:ガラス上のCTAB@AuNRs(左パネル)、プラズモン膜上のCTAB@AuNRs(右パネル)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CTAB被覆金ナノロッド(CTAB-AuNR)	ナノシード	NR-40-650	85 nm*40 nm
カラーCMOSカメラ	オリンポス	DP74	日本
カバースリップ	シトグラス	z10212222Cさん	22 × 22
暗視野顕微鏡	ニコン	80iの	正立顕微鏡
ウシ胎児血清(FBS)	ギブコ	10099141
フィジー	国立衛生研究所	2.0.0-RC-69 / 1.52 P	ImageJの分布
溝付きスライドガラス	セイルブランド	7103	シングルコンケーブ
画像J	画像J	1.52円
MATLAB	MathWorksの	R2019bの
MATLAB コード			https://github.com/fenggeqd/ ジョーブ-2020
プラスチック細胞培養皿	隼	353002
プラスチック細胞培養皿	隼	353001	35 × 10
U87 MGセル	アメリカンタイプカルチャーコレクション	ATCC HTB-14	ヒト原発性膠芽腫細胞株
最小必須媒体(MEM)	ギブコ	51200038	フェノールレッドなし
ペニシリン-ストレプトマイシン	ギブコ	15140122