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微小管ダイナミクスのラベルフリー可視化のための干渉反射顕微鏡法

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出典:Mahamdeh, M., et al.ラベルフリーで微小管の高速イメージングのための干渉反射顕微鏡法の実装。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、適切なバッファーの存在下でカバースリップ表面に成長する微小管を視覚化する干渉反射顕微鏡(IRM)技術について説明します。入射光で照らすと、カバースリップ-バッファー界面とバッファー-微小管界面が光を反射し、これが組み合わさって干渉パターンを形成することで、明るい背景に対して微小管を高コントラストの画像として視覚化できます。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 顕微鏡の改造と対物レンズ

  1. 適切なフィルターキューブを使用して、蛍光顕微鏡のフィルターホイールに50/50ミラーを挿入します(図1)。50/50ミラーは、反射防止コーティングが施されていることが多いため、取り扱いに注意してください><。 手記：顕微鏡の空のフィルターキューブに50/50ミラーを使用しました。50/50ミラーは、ダイクロイックミラーが配置されている場所に挿入されます。
  2. 高倍率/高開口数(NA)のオイル対物レンズを使用してください.
    手記：このプロトコルでは、100x/1.3 NA対物レンズを使用しました。

2. 微小管を表面に付着させるためのチャンバー調製

  1. 顕微鏡スライドと22 mm x 22 mmカバースリップ(正立顕微鏡用)または22 mm x 22 mmおよび18 mm x 18 mmカバースリップ(倒立顕微鏡用)。必要に応じてサーフェスを修正します。たとえば、アルカリ性洗剤(材料の表を参照)を使用してカバーガラスを洗浄し、その後、蒸留水で100%エタノールを洗浄します。
    2. 幅
  2. 3 mmのプラスチックパラフィンフィルム(材料の表....

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Results

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figure-results-1
図 1.IRM の概略図。(A)光源からの落射照明は、50/50ミラーに到達する前に絞りダイアフラムを通過します。開口絞りはビーム幅を設定し、照明NAを設定します。50/50ミラーは、光を部分的に対物レンズまで反射してサンプルを照らします。サンプルから反射された光は収集され、カメラチップ(真空管レンズ)に投影され、そこで干渉して画像が生成されます。画像のコントラストは、ガラス/水界面(I1)から反射された光と、水/微小管界面(I2)から反射された光との間の干渉の結果です。微小管/表面距離(h)に応じて、I1とI2の間の光路の違いは、建設的(明るい信号)または破壊的な(暗い信号)、またはその中間の何かをもたらします。例えば、波長600nmの光を撮像すると、微小管の高さが約100nm変化すると、暗い光と明るいコントラストが切り替わります。アスタリスクは共役平面を示します。(B)50/50ミラーのインストール例。適切なフィルターキュ.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
利益相反は宣言されていません。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
顕微鏡ニコンタイエクリプスエクスプリメントのパフォーミングに使用される倒立顕微鏡
50/50ビームスプリッター彩度21000購入の際は、顕微鏡で使用するキューブに合うスプリッターの寸法を必ず選択
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 アイリス対物レンズニコンMRH02902イメージング対物レンズ。この対物レンズには、NA 1.3 に開かれた NA 調整アイリスがあります
ムカソル万能洗剤シグマ・アルドリッチZ637181-2Lカバースリップやスライドのクリーニングに使用
プラスチックパラフィンフィルム(商業名パラフィルムM)シグマ・アルドリッチP7793流路の構築に使用
抗TAMRA抗体インビトゲンA-6397TAMRA標識分子(微小管など)をサンプル表面に結合するために使用されます。RRIDの (AB_2536196)
ポロクサマー407(商品名プルロニックF-127)シグマ・アルドリッチ非特異的結合を防ぐためにチャネル表面をブロックするために使用されます
40 nm金ナノ粒子シグマ・アルドリッチ753637コントロールサンプルとして使用
20 nm金ナノ粒子シグマ・アルドリッチ753610コントロールサンプルとして使用
Zyla 4.2 カメラアンドールZyla 4.22048x2048ピクセル(6.5μmピクセルサイズ)、量子効率72%、16ビットダイナミックレンジ
Feista追跡ソフトウェアhttps://www.bcube-dresden.de/ フィエスタ/ウィキ/フィエスタ
安定化微小管社内で準備(本文中の参考文献を参照)
してください 型 の

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