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1. 顕微鏡の改造と対物レンズ
- 適切なフィルターキューブを使用して、蛍光顕微鏡のフィルターホイールに50/50ミラーを挿入します(図1)。50/50ミラーは、反射防止コーティングが施されていることが多いため、取り扱いに注意してください><。
手記：顕微鏡の空のフィルターキューブに50/50ミラーを使用しました。50/50ミラーは、ダイクロイックミラーが配置されている場所に挿入されます。
- 高倍率/高開口数(NA)のオイル対物レンズを使用してください.
手記：このプロトコルでは、100x/1.3 NA対物レンズを使用しました。
2. 微小管を表面に付着させるためのチャンバー調製
- 顕微鏡スライドと22 mm x 22 mmカバースリップ(正立顕微鏡用)または22 mm x 22 mmおよび18 mm x 18 mmカバースリップ(倒立顕微鏡用)。必要に応じてサーフェスを修正します。たとえば、アルカリ性洗剤(材料の表を参照)を使用してカバーガラスを洗浄し、その後、蒸留水で100%エタノールを洗浄します。
幅- 3 mmのプラスチックパラフィンフィルム(材料の表を参照)のストリップを、かみそりの刃と別の顕微鏡スライドを端として使用してカットします。
- 2 つのプラスチックパラフィンフィルムストリップを3 mm離して、清潔な22 x 22mmのカバースリップに置きます。次に、18 mm x 18 mmのカバースリップをセットしてチャネルを形成します。正立顕微鏡を使用する場合は、清潔な顕微鏡スライドの上にストリップを置き、次にカバースリップを上に置きます。
- カバーガラス(またはスライド)を100°Cのヒートブロックに10〜30秒間置き、パラフィンフィルムが密閉されたチャネルを形成します。
- 50 μg/mL の抗体 (Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) をピペットで灌流して流します。10分間インキュベートします.
手記： 抗ローダミン抗体を用いて、ローダミン標識微小管の種子を表面に結合します。あるいは、アビジンを使用して、ビオチン標識微小管シードまたはビオチン化金粒子に結合することもできます。溶液中にチューブリンが存在しない状態で微小管を単純に観察するには(つまり、非動的アッセイ)、抗チューブリン抗体を使用することができます。
- BRB80バッファーで5回洗浄します。溶液は0.22μmフィルターを使用してろ過することをお勧めします。
- BRB80に1%ポロキサマー407(トリブロック共重合体)を流して、非特異的結合に対して表面をブロックします。10分間インキュベートします。
- BRB80バッファーで5回洗浄します。
- サンプルを顕微鏡にセットする準備が整いました。サンプルの乾燥を防ぐため、チャネルの端にBRB80バッファーの液滴を2滴加え、必要に応じて補充します。
3. 顕微鏡のアライメント
- サンプルを顕微鏡ステージに置きます。落射照明光源をオンにします。
- サンプル表面に焦点を当てます。光路内の光学系からの光の後方反射により、対物レンズが上下に動くため、複数の表面を観察します。サンプル表面を見つける良い方法は、パラフィンフィルムの端に焦点を合わせることです。表面が見つかったら、視野をチャンバーの中心に設定します。
- フィールドダイヤフラムを視野の中央に配置するには、ダイヤフラムを半分閉じて調整ネジを使用します。位置合わせが完了したら、ダイヤフラムを再度開きます.
手記：ネジの調整は、おそらく3〜6か月ごと、またはトラブルシューティング時に、散発的に行う必要があります。
- ベルトランレンズをスライドさせて、対物レンズの射出瞳(後焦点面)を確認します。
- 対物レンズの射出瞳の端を超えて絞り絞り(AD)を閉じます。
- 調整ネジを使用して、ADを出口瞳の中央に配置します。ADを開き、その端を出口の瞳孔の端と一致させて再確認します
手記：この調整は散発的に行う必要があります。
- 絞りを対物レンズのNAの約2/3に設定します。
4. 安定化微小管または40nmの金粒子のイメージング
>注:安定化された微小管と金ナノ粒子は、良好な対照サンプルとして機能します。IRM性能を評価し、最適な開口ダイアフラム開口部を設定するための最初のステップとして、表面付着した微小管または金ナノ粒子を画像化することをお勧めします(セクション7)。
- カメラの露光時間を10msに設定し、カメラのダイナミックレンジがほぼ飽和するように照明を調整します。
- 10 μLのグアニル-(アルファ、ベータ)-メチレンジホスホネート(GMPCCP)-またはタキソール安定化微小管をBRB80(または40 nm金粒子)に流し、ピペットを使用して新鮮なサンプルに灌流し、表面をイメージングして結合を監視します。10〜20個の微小管が視野内に結合したら、サンプルをBRB80.
で2回洗浄します
手記：整列した顕微鏡では、微小管はバックグラウンドの減算なしで見えるはずです。
1- 秒の遅延時間を10秒間のタイムラプス(露出10ms時)に設定して、10枚の画像を取得します。
- 背景画像を取得します。これを行うには、ステージコントローラーまたはコンピューターソフトウェアを使用して、チャネル長軸に沿ってステージを移動させ、遅延なく100枚の画像を取得します(つまり、100 fps @ 10 msの露出に近いストリーミング)。
手記： 背景は100枚の画像の中央値です。中央値を取ることにより、照明プロファイルや光学系上の汚れなどの他の静止した特徴は保持され、他のすべてがフィルタリングされます。サンプルに傾きがあってはならないのは、ステージが移動するにつれて軸方向の位置が変化し、最終的に背景画像が劣化するためです。傾きが避けられない場合は、別の方法として、種子を流す前に平均化された背景画像を取得する方法があります。
- イメージの処理と分析については、ステップ 6 に進みます。
5. 微小管ダイナミクスのイメージング
- 脳チューブリンを用いた微小管ダイナミクスでは、サンプルヒーターの温度を37°Cに設定します。
- BRB80中のGMPCCP安定化微小管シード10 μLをピペットで灌流して新鮮なサンプルに流し、表面に結合する様子をライブで(つまり、ストリーミングしながら)イメージングすることで、表面に結合するのをモニターします。10〜20個のシードが視野に結合したら、BRB80で2倍チャネル容量を使用してサンプルを洗浄します(BRB80は37°Cまたは少なくとも室温で予温する必要があります)
手記：整列した顕微鏡を使用すると、シードはバックグラウンドの減算なしで見えるはずです。
- 重合ミックス(7.5 μM標識チューブリン+1 mMグアノシン三リン酸(GTP)+1 mMジチオスレイトール(DTT))のBRB80バッファー中のフロー。微小管の成長を測定するには、取得ソフトウェアを使用してタイムラプスを設定し、5秒(0.2フレーム/秒(fps))ごとに15分間画像を取得します。
- コントラストを高めるには、各時点で 10 枚の画像 (1 枚ではなく) を取得し、それらを平均化します。微小管の収縮については、遅延時間を0、露光時間を10msに設定して、100fpsで画像を取得します(使用するカメラによっては、関心のある領域が小さくなると、より高いfpsが可能になります)。
- 手順4.4のように背景画像を取得します。
>6. 画像処理と解析
>注:分析のために、このプロトコルはフィジーを使用しますが、読者は適切だと思うソフトウェアを自由に使用できます。
- 保存した背景画像を開きます。
- Image > Stack > Z project > Medianを使用して、画像の中央値(背景)を計算します。
- File > Openを使用して、微小管ダイナミクスムービーをスタックとして開きます(非動的微小管の場合も同じ)。
- [Process > Image calculator] を使用して、スタックから背景画像を減算します。「32bit(float)結果」オプションを必ず確認してください。
- 動的微小管の場合、線ツールを使用して目的の微小管に沿って線を引き、「t」を押して関心領域マネージャーに追加します。目的のすべての微小管について繰り返します。
- 動的微小管の場合は、Multi-Kymoマクロを実行します。このマクロは、ROIマネージャー内のすべての微小管のビデオとキモグラフを生成します。すべての微小管は一意の識別子を取得します。
- 動的微小管の場合は、Kymo-Analysis マクロを実行し、その手順に従って微小管の成長速度と収縮速度を測定します。
>7. 絞りサイズ
>注:IRMを使用して微小管の高コントラスト画像を取得するための重要な要素は、照明の開口数(INA)を正しく設定することです。INAは、ADのサイズによって制御される対物レンズの射出瞳に入射する照明ビームのサイズを変更することで変更できます(ADは、対物レンズの射出瞳(後焦点面)との共役平面にあります(図1)。
ここで、DADは絞りの直径、f対物レンズは対物レンズの焦点距離、Depは対物レンズの射出瞳径です。通常、ADは蛍光イメージングのために完全に開いたままになっているため、INAは対物レンズのNAと等しくなります。蛍光顕微鏡では、ADスケールはその直径を示していないため、INAを計算することはできません。対物レンズの助けを借りてADサイズを調整することが可能です。ただし、AD サイズは最もコントラストの高いサイズに固定されるため、必要ありません。
- 表面に付着した蛍光標識された安定化微小管のサンプルを調製します(ステップ4.1-4.2).
手記：テトラメチルローダミン標識微小管(Ex:550 nm、Em:580 nm)を使用しました。
- 顕微鏡のフォーカシングノブを使用して微小管にピントを合わせ、蛍光イメージングします(微小管が標識されていない場合は、IRMまたはDICでイメージングします)。
- カメラソフトウェアを使用してカメラの露出を10ミリ秒に設定します。
手記：この露出は任意であり、100 ミリ秒の露出でも機能します。
- ADを最小の開口部まで閉じます。カメラのダイナミックレンジをほぼ飽和させるか、可能な限り最大に照らすように照明を調整します.
手記：目安として、通常は集録ソフトウェアが提供するルックアップテーブルを使用してください。
- 10+微小管を含む視野の10枚の画像(ストリーミングまたは毎秒の画像撮影)を取得します。
- 手順4.4のように背景画像を取得します。
- ADのサイズを変更し、ADの開口部範囲全体に対して手順7.5〜7.6を繰り返します(閉じた状態から出口の瞳孔サイズまで、図2)。ADサイズを変更するたびに、手順7.4の明るさと一致するように照明強度を調整します。
- 取得した視野ごとに、Process > Image Calculator を使用し、ドロップダウンメニューから「減算」を選択して、対応する背景を減算します。「32bit (float) result」オプションにチェックが入っていることを確認します。次に、Z プロジェクトの > >スタック イメージを使用して、結果のイメージを平均化します>。
- 微小管信号の平均強度(微小管の強度からバックグラウンドの強度を差し引いたもの)をバックグラウンドの標準偏差で割った値として定義される微小管のS/S/バックグラウンド雑音比(SBR)を測定します(図3)。
- 各開口部サイズに対する微小管の平均SBRを計算して最適なADサイズ(つまり、最適なINA)を決定し、ADサイズを最も高いSBRを生成するものに設定します(図2)。同等のコントラストを生成するADサイズの範囲が存在する可能性があります。
