アセンブルされたヌクレオソームを可視化し、特性評価するための静的原子間力顕微鏡

Abstract

出典:Stormberg, T., et al.原子間力顕微鏡イメージングを使用したヌクレオソームの構造とダイナミクスの調査。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、組み立てられたヌクレオソームを視覚化するための静的原子間力顕微鏡法を実演します。この高解像度イメージング技術により、ヌクレオソーム構造の研究が可能になります。

Protocol

1. ヌクレオソームの静的AFMイメージングのためのマイカ表面の機能化

1. 記載されているように、脱イオン水中に50 mM 1-(3-アミノプロピル)シラトランAPSストック溶液を調製します。この溶液の1 mLアリコートは、使用するまで4°Cで保存してください
   手記：アリコートは4°Cで1年以上保存できます。
2. マイカ修飾用のAPS 1:300溶液を調製するには、50 mM APSストックの50 μLを15 mL dd H₂O.
   に溶解します。 手記：この作業溶液は、室温で数日間保存できます。
3. 高品質のマイカシートからマイカの1 x 3 cmのストリップを切り取ります(ここで使用するマイカの材料表を参照)。
   1. キュベットに斜めに置いたときにピースが収まることを確認してください。鋭利なピンセット、カミソリの刃、またはスコッチテープの先端を使用して、雲母の層を切断し、両面が新たに切断され、ピースが~0.1mmまで薄くなるまで切断します(図1A)。直ちにマイカピースをAPS充填キュベットに入れ、30分間インキュベートします(図1B)。
4. マイカ片をdd H2Oで満たされたキュベットに移し、30秒間浸します(図1C)。APS-マイカストリップの両側をアルゴン流下で完全に乾燥させます.
   手記：不織布セルロースとポリエステルのクリーンルーム用ワイプ(材料に詳述されている推奨ワイプ)は、乾燥時にマイカの端から水を吸い上げるのを助けるために使用できます。
5. ここでドライマイカストリップをサンプル調製に使用します。それ以外の場合は、ピースを清潔で乾燥したキュベットに保管します(図1D).
   手記：環境が湿度が高い場合は、真空中で1〜2時間追加で保管することをお勧めします。ここでプロトコルを一時停止できます。

>2. 静的AFMイメージングのためのAPS-Mica上のヌクレオソームサンプルの調製

1. 両面粘着テープをいくつかの磁気パックに貼り、横に置きます。
2. APS-mica基板を希望のサイズ(ここで使用するMM AFM装置の場合は1 x 1 cm四方)にカットします。これらのピースをきれいなシャーレに入れ、蓋をしたままにします。
3. 10 mM HEPES pH 7.5 および 4 mM MgCl₂.
   を含む 0.22 μm フィルターバッファーを使用して、組み立てたヌクレオソーム (最終ヌクレオソーム濃度 0.5、1.0、および 2.0 nM) を 3 希釈液で調製します 手記：低い最終濃度でのヌクレオソームの損失を制限するために、希釈はAPS-マイカへの沈着の直前に一度に1つずつ行う必要があります。
4. 希釈したヌクレオソームサンプルを5-10 μLをAPS-micaピースの中央に沈殿させ、2分間インキュベートします。サンプルを2〜3 mLのdd H₂Oで穏やかにすすぎ、すべての緩衝成分を取り除きます。dd H₂O を ~0.5 mL 使用するごとに、マイカを静かに振って余分なすすぎ水を取り除きます
   手記：このすすぎステップには使い捨てシリンジをお勧めします。
5. 堆積したサンプルをきれいなアルゴンガスの軽い流れで乾燥させます.
   手記：これで、サンプルをイメージングする準備ができたか、アルゴンで満たされた真空キャビネットまたはデシケーターに保管できます。記載されているように調製および保存されたサンプルは、調製後1年で、品質を損なうことなく画像化されています。ここでプロトコルを一時停止できます。

>3. ヌクレオソームの静的AFMイメージング

1. AFMチップをチップホルダーに取り付けます。スプリング定数が ~40 N/m で、共振周波数が 300 から 340 kHz のチップを使用します (ここで使用するカンチレバーについては、材料表を参照してください)。
2. セクション3で調製したサンプルを、サンプル表面に接触しないように注意しながらAFMステージに取り付けます。
3. 合計が最大になるまでレーザーをカンチレバー上に置き、垂直方向と横方向のたわみ値をゼロ近くに調整します。
4. AFMプローブを調整して共振周波数を見つけ、駆動振幅を調整して、画像サイズを100 x 100 nmに設定します。エンゲージボタンをクリックしてアプローチを開始します。
5. 近づいたら、サンプルの表面がはっきりと見えるまで、振幅設定値を徐々に最適化します。スキャンサイズを1 x 1 μmに、解像度を512 x 512ピクセルに増やします。キャプチャボタンに続いてエンゲージボタンをクリックすると、画像取得が開始されます。
   手記：図2の画像は、これらのサンプルをイメージングする際に期待できる滑らかな背景を示しています。

Results

図1:ヌクレオソームのAFMイメージング用にAPS官能基化マイカを調製するプロセスの概略図。(A)厚さ~0.1mmのマイカの両面が新たに切断されています。(B)切断されたマイカピースは、APS溶液を含むキュベットに対角線上に置かれ、30分間インキュベートされるように設定されます。(D)APS-マイカピースは、使用するまでキュベットに保管します。

図2:H3およびCNEP-AヌクレオソームのAFM画像の例(A)静的AFMを使用してキャプチャされたAPS-mica上に堆積したH3モノヌクレオソームのサンプル画像。各明るい塊はヌクレオ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CENP-A/H4)2、組換えヒト	EpiCypher、ノースカロライナ州ダーラム	〒16-0010	カタログ番号 for 50 ug
H2A/H2B、組換えヒト	EpiCypher、ノースカロライナ州ダーラム	〒15-0311	カタログ番号 for 50 ug
H3オクタマー、組換えヒト	EpiCypher、ノースカロライナ州ダーラム	〒16-0001	カタログ番号 for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置キット、10K MWCO、0.1 mL	ThermoFischer Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム	69574	10台のデバイスのカタログ番号
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	S9888-500G	カタログ番号:500mg
Amicon Ultra-0.5 mL 遠心フィルター	ミリポアシグマ、ミズーリ州バーリントン	UFC501008	8台のデバイスのカタログ番号
HCl	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	258148-25ミリリットル	カタログ番号 for 25 mL
トリシン	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	T0377-25G	カタログ番号 for 25 g
SDSの	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	11667289001	カタログ番号 1kg用
過硫酸アンモニウム(AmmPS)	バイオ・ラッド、カリフォルニア州ヘラクレス	1610700	カタログ番号 for 10 g
30% アクリルアミド/ビス溶液、37.5:1	バイオ・ラッド、カリフォルニア州ヘラクレス	1610158	カタログ番号 for 500 mL
テメド	バイオ・ラッド、カリフォルニア州ヘラクレス	1610800	カタログ番号 for 5 mL
4x Laemmli タンパク質サンプルバッファー(SDS-PAGE用)	バイオ・ラッド、カリフォルニア州ヘラクレス	1610747	カタログ番号 10mL用
2-ミー	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	M6250-10ミリリットル	カタログ番号 10mL用
ageRuler 染色済みプロテインラダー	ThermoFischer Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム	26616	カタログ番号 500 uL
バイオセーフ™ クーマシーステイン	バイオ・ラッド、カリフォルニア州ヘラクレス	1610786	カタログ番号 1L用
不織布クリーンルームワイプ:TX604テクニクロス	TexWipe、ノースカロライナ州カーナーズビル	TX604
白雲母ブロックマイカ	アッシュビルマイカ、ニューポートニューズ、バージニア州	グレード-1
ヘープス	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	H4034-25G(英語版)	カタログ番号 for 25 g
セロハンテープ	Scotch-3M、ミネソタ州セントポール
TESPA-V2 AFMプローブ(静止画用)	Bruker AFM Probes、カリフォルニア州カマリロ
Millex-GPフィルター、0.22 μm	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	SLGP05010	10台のデバイスのカタログ番号
BL-AC10DS-A2 AFMプローブ(HS-AFM用)	オリンパス(日本)
マルチモード原子間力顕微鏡	Bruker-Nano/Veeco、カリフォルニア州サンタバーバラ