ヌクレオソームダイナミクスを捉える高速タイムラプス原子間力顕微鏡

要約

出典:Stumme-Diers, M. P., et al., 原子間力顕微鏡イメージングを用いたヌクレオソームの構造とダイナミクスの調査。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、ヌクレオソーム複合体のダイナミクスを研究するための高速タイムラプス原子間力顕微鏡、AFM、イメージング技術を実演します。AFMチップがヌクレオソームの表面を走査すると、ヌクレオソームの高さの変化が検出され、DNAの経時的な解き放たれが記録されます。

プロトコル

1. モノヌクレオソームの連続希釈集合体

1. オフセンターのWidom 601ヌクレオソームポジショニング配列を含む約400 bpのDNA基質を作製および精製します。
   手記：ジヌクレオソームの望ましくない形成を制限するために、ポジショニングシーケンスに隣接する各「アーム」は~150 bpを超えてはなりません。
   1. プラスミドpGEM3Z-601を設計されたプライマーとともに使用し、PCRを使用して基質DNAを増幅します。ここで使用するアーム長が122bpと154bpの423 bp基質には、フォワード(5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3')およびリバース(5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3')プライマーを使用します。
   2. 反応混合物の入ったチューブを95°Cに予熱したサーマルサイクラーに加えます。最初の変性を95°Cで5分間行った後、次のプログラムを33サイクル実行します。95°Cで30秒の変性、49°Cで30秒のアニール、72°Cで35秒の延長を行います。33サイクル後に72°Cで10分間の最終延長を設定します。
   3. 市販のPCR精製キットを使用して、PCR混合物からDNAを精製します。PCRクリーンアップカラムからDNAを溶出する場合は、キット付属の溶出バッファーの代わりに10 mM Trisバッファー(pH 7.5)を使用してください
      手記：精製ステップ間でバッファーを移さないように特に注意してください。汚染された溶離液は、DNA濃度を測定する際に下流で問題を引き起こしたり、ヌクレオソーム集合体混合物の開始塩濃度を変化させたりする可能性があります。
2. 精製されたDNAの吸光度を260nmで測定することにより、DNA濃度を測定します。
   1. 10 mM Tris pH 7.5溶出バッファーのみを使用して、UV VIS分光光度計でブランクを収集します。精製されたDNAの測定値を収集します。
3. 濃度を決定したら、精製したDNAの25pmolを0.6mLのマイクロチューブに分注し、溶液がほとんど見えないまで真空遠心分離機に入れます<これは通常、30分から1時間ですbr /> 手記：これで、DNA基質はヌクレオソームアセンブリの準備が整いました。それ以外の場合は、ここでプロトコールを一時停止し、使用するまでDNAを-20°Cで保存することができます。
4. 25 pmol DNAを含むマイクロフュージチューブを氷の上に置き、表1のヌクレオソームアセンブリコンポーネントをリストされている順序で追加します。すべての成分を添加したら、混合物を氷から取り出し、室温(RT)で30分間インキュベートします
   手記：2 Mの最終濃度を達成するために必要なNaClを計算する際には、ストックヒストンバッファーの塩分含有量を考慮することが重要です。
5. 連続希釈を使用して、混合物の2 M塩濃度を200 mMに減らしてヌクレオソームを組み立てます。
   1. 10 mM Tris pH 7.5 を含む 100 μL の希釈バッファーをシリンジに充填し、シリンジポンプに置きます。
   2. シリンジの針をマイクロフュージチューブのキャップにあらかじめ穴を開けた穴に通し、アセンブリ混合物と接触することを確認します(図1)。
   3. シリンジポンプを0.75μL/minの速度で120分間運転します.
      手記：得られた100 μL溶液には、250 nMのヌクレオソームと200 mM NaClが含まれています。
   4. 混合物を10 K MWCO透析ボタンに移し、10 mM Tris pH 7.5、0.25 mM EDTA、および2.5 mM NaClを含む200 mLの予冷済み(4°C)低塩緩衝液に対して、4°Cで1時間透析します。
6. ヌクレオソームアセンブリのヒストン含有量を評価するには、前述のように15%の分離と6%のスタッキングで不連続SDS-PAGEゲルを調製します。
   1. ヌクレオソームストック10 - 20 μLをマイクロチューブに分注し、4x Laemmli Sample Bufferを1 - 2xの作業濃度まで加えます。
   2. コントロールとして、この調製を別のマイクロチューブで1〜2μgのヒストンストックに対して繰り返します。サンプルを95°Cで~5分間加熱します。
   3. 隣接するレーンのサンプルをゲル上にロードします。未使用のレーンにサンプル バッファーを追加して、バンドの移行を均等にします。
   4. ゲルを65Vで泳動し、染料の前面がスタッキングゲルを通過するまで泳ぎます。分離ゲルに到達したら、150 Vに増やし、色素前面がゲルから完全に移動するまで泳ぎます。
   5. 電気泳動ユニットを分解し、ゲルをdd H₂Oで満たされた染色容器に穏やかに移します。ゲルを穏やかに攪拌しながら5分間放置します。このプロセスをさらに2回繰り返し、毎回新しいdd H₂Oを使用します。
      手記：このプロトコールで使用されるクマシー染色は、クマシー染色に必要な一般的な固定手順を必要としません(材料表を参照)。別のCoomassie準備を使用している場合は、必要に応じて固定手順を調整します。
   6. 最後のすすぎから水を取り除き、ゲルを覆うのに十分な汚れを追加します。ゲルを穏やかに攪拌しながら少なくとも1時間放置します.
      手記：攪拌のために、染色容器は、ゲルを液体で覆ったままにしながら、ゲル上の染色物の動きを促進する任意の装置に配置できます。
   7. 容器から汚れを取り除き、dd H₂Oでゲルをすすぎ、dd H₂Oを交換し、穏やかに攪拌しながらゲルを30分間浸します。(ゲルは図2のように見え、ヒストンバンドが明確に分離されています。
7. ヌクレオソームは使用まで4°Cで保存します.
   手記：これらの条件で保存すると、ヌクレオソームは数ヶ月間安定したままです。ここでプロトコルを一時停止できます。

2. ヌクレオソームダイナミクスの高速タイムラプスAFMイメージング

>注:以下のプロトコルは、安藤グループ(金沢大学、日本、金沢)によって開発されたHS-AFM装置に対して提供されています。

1. 液体イメージング用のAPS-micaを準備します。
   1. ガラスロッドスキャナー接着剤を使用して、ガラスロッドをAFMスキャナーステージに取り付けます(材料の表を参照)。これを最低10分間乾燥させます。
   2. 直径1.5mmの直径の雲母を厚さ~0.1mmの円形の雲母に、大きな雲母シートから打ち抜いて作る。HS-AFMマイカガラスロッド接着剤(材料の表を参照)を使用して、このマイカピースをHS-AFMのガラスロッドに取り付け、手つかずで最低10分間乾燥させます。感圧テープを使用して、テープによく劈開した層が見られるまで層を劈開します。
   3. 50 mM APSストック1 μLを99 μLのdd H₂Oで希釈し、500 μM APS溶液を調製します。この溶液2.5μLを新たに切断したマイカ表面に沈着させ、30分間官能基化させます
      手記：機能化中の表面の乾燥を防ぐために、50 mLの円錐形遠心分離管のキャップを湿らせた濾紙に取り付けてスキャナーの上に置くことができます。APSストックは、AFMで観察できる速度にダイナミクスを制御するために、液体イメージングでは静的イメージングよりも3倍少なく希釈されています。
   4. マイカを20 μLのdd H₂Oで数回~3 μLのリンスを適用してすすぎます。各すすぎ後、マイカの端に不織布ワイプを置いて、水を完全に取り除きます。最終すすぎ後、~3 μL の dd H₂O を表面に置き、5 分間以上放置して、特異的に結合していない APS を除去します。
2. プローブをHS-AFMホルダーにセットし、先端を上にしてホルダーをAFMステージ上に置きます。~100 μL の dd H₂O を使用してホルダーをすすぎ、続いて 10 mM HEPES、pH 7.5、4 mM MgCl₂ を含む 0.22 μm フィルター済みヌクレオソームイメージングバッファーを ~100 μL 2 回すすぎます。
3. すすぎが完了したら、チャンバーに~100 μLのヌクレオソームイメージングバッファーを充填し、チップを沈めます。レーザーが当たるまでカンチレバーの位置を調整します。APS-マイカを20 μLのろ過済みヌクレオソームイメージングバッファーですすぎます(すすぎあたり~4 μL)。
4. ヌクレオソーム集合体ストック1 μLを250 μLのろ過済みヌクレオソームイメージングバッファーに希釈して、最終ヌクレオソーム濃度を1 nMにします。この希釈液の2.5μLを表面に堆積させ、2分間放置します。表面を~4 μLのヌクレオソームイメージングバッファーで2回すすぎます。最終すすぎ後、表面をイメージングバッファーで覆ったままにします。
   手記：ヌクレオソーム試料を堆積させた後に表面をすすぎないと、表面は急速に過密状態になります。
5. スキャナーとサンプルをチップホルダーの上に置き、サンプルが下向きになるようにします。アプローチを開始するには、設定点振幅 A_s を自由振動振幅 A₀ に近づけるオート アプローチ機能を使用します。(
   手記：理想的には、_{A s} = 0.95 A₀ですが、注意すれば、A₀の82%で動作することも同様に機能します。
6. 表面がよく追跡されるまで設定値を調整します。
   手記：AFMチップからヌクレオソームサンプルへのエネルギーの伝達を最小限に抑えるには、カンチレバーの振幅を小さく保ち、振幅を1 nmまで低く
抑える必要があります。
7. 画像領域を約 150 x 150 nm から 200 x 200 nm に設定し、イメージング フレームあたり ~300 ms のデータ取得速度を設定します。
   手記：この画像サイズは、通常、複数のヌクレオソームのダイナミクスを同時に捉えるのに十分です。人口の少ないサーフェスでは、これらのパラメータの変更が必要になる場合があります。推奨されるフレームレートは、ループ、スライディング、アンラッピングなどのヌクレオソームダイナミクスをキャプチャするのに十分です(以下の「代表的な結果」セクションを参照)。

>表1:連続的な塩勾配ヌクレオソームの組み立てに必要な試薬。 リストされた各成分は、精製されたDNAを含むマイクロフュージチューブに添加されます。これは、試薬が表に記載されている順序で、最初に水とNaClを追加し、次にH2A/H2Bダイマーとヒストンテトラマーを最後に追加して行う必要があります。あらかじめ折りたたまれたヒストン八量体を使用する場合は、上記の四量体と同じ比率でそれらを追加します。*各ヒストンストックのNaCl含有量に注意し、5M NaClを調整してそれに応じて追加し、最終的な[NaCl]は2Mに等しくなります(材料の表を参照)。

結果

図1:マイクロスケールのヌクレオソームアセンブリに使用されるシリンジポンプの概略図。アセンブリ混合物は、シリンジニードルの端に接触するように配置されています。希釈バッファーがシリンジポンプによって集合混合物に送達されると、NaClの濃度が減少し、ヌクレオソームの集合が促進されます。この図は、Stumme-Diersらから採用されています。

図2:アセンブルされたヌクレオソームのSDS-PAGE。 レーン 1 と 2 には、それぞれヒストンの H3 八量体と CENP-A アセンブリが含まれています。レーン3およびレーン4は、それぞれ、アセンブルされたH3ヌクレオソームおよびアセンブルされたCENP-Aヌクレオソ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プラスミド pGEM3Z-601	Addgene、マサチューセッツ州ケンブリッジ	26656
PCRプライマー	IDT、アイオワ州コーラルビル	カスタムオーダー	(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP)5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaqポリメラーゼ	ThermoFischer Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム	EP0701	カタログ番号 200個分
PCR精製キット	Qiagen, Hilden, ドイツ	28104	カタログ番号 for 50
トリスベース	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	10708976001	カタログ番号 for 250 g
EDTAの	ThermoFischer Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム	15576028	カタログ番号 500g
(CENP-A/H4)2、組換えヒト	EpiCypher、ノースカロライナ州ダーラム	〒16-0010	カタログ番号 for 50 ug
H2A/H2B、組換えヒト	EpiCypher、ノースカロライナ州ダーラム	〒15-0311	カタログ番号 for 50 ug
H3オクタマー、組換えヒト	EpiCypher、ノースカロライナ州ダーラム	〒16-0001	カタログ番号 for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置キット、10K MWCO、0.1 mL	ThermoFischer Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム	69574	10台のデバイスのカタログ番号
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	S9888-500G	カタログ番号:500mg
Amicon Ultra-0.5 mL 遠心フィルター	ミリポアシグマ、ミズーリ州バーリントン	UFC501008	8台のデバイスのカタログ番号
HCl	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	258148-25ミリリットル	カタログ番号 for 25 mL
トリシン	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	T0377-25G	カタログ番号 for 25 g
SDSの	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	11667289001	カタログ番号 1kg用
過硫酸アンモニウム(AmmPS)	バイオ・ラッド、カリフォルニア州ヘラクレス	1610700	カタログ番号 for 10 g
30% アクリルアミド/ビス溶液、37.5:1	バイオ・ラッド、カリフォルニア州ヘラクレス	1610158	カタログ番号 for 500 mL
テメド	バイオ・ラッド、カリフォルニア州ヘラクレス	1610800	カタログ番号 for 5 mL
4x Laemmli タンパク質サンプルバッファー(SDS-PAGE用)	バイオ・ラッド、カリフォルニア州ヘラクレス	1610747	カタログ番号 10mL用
2-ミー	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	M6250-10ミリリットル	カタログ番号 10mL用
PageRuler 染色済みタンパク質ラダー	ThermoFischer Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム	26616	カタログ番号 500 uL
バイオセーフ™ クーマシーステイン	バイオ・ラッド、カリフォルニア州ヘラクレス	1610786	カタログ番号 1L用
不織布クリーンルームワイプ:TX604テクニクロス	TexWipe、ノースカロライナ州カーナーズビル	TX604
白雲母ブロックマイカ	アッシュビルマイカ、ニューポートニューズ、バージニア州	グレード-1
アミノプロピルシラトラン(APS)	22 で説明されているように合成されます
ヘープス	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	H4034-25G(英語版)	カタログ番号 for 25 g
セロハンテープ	Scotch-3M、ミネソタ州セントポール
アロンアルファインダストリアルクレイジーグルー	東亞合成アメリカ、ウェストジェファーソン、オハイオ州	AA480	カタログ番号 2gチューブ用
MgCl2	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	M8266-100G	カタログ番号 for 100g
Millex-GPフィルター、0.22 μm	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州セントルイス	SLGP05010	10台のデバイスのカタログ番号
BL-AC10DS-A2 AFMプローブ(HS-AFM用)	オリンパス(日本)
コンパウンドFG-3020C-20	フロロテクノロジー株式会社、Kagiya、Kagungai、愛知県、日本
コンパウンド FS-1010S135-0.5	フロロテクノロジー株式会社、Kagiya、Kagungai、愛知県、日本
高速タイムラプス原子間力顕微鏡	安藤 俊夫(金沢大学ナノ生命科学研究所、金沢市角間町)