ヒト骨格筋におけるグリコーゲン分布を定量化するための透過型電子顕微鏡

要約

出典: Jensen, R., et al. Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp.(2022年度)

このビデオでは、ヒト骨格筋組織のサンプル調製と透過型電子顕微鏡による染色を行い、細胞内グリコーゲン分布を可視化・定量化する様子を実演します。

プロトコル

人間の参加者が関与するすべての手続きは、人間の福祉に関する制度的、国内的、および国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査

されています

>1. 一次固定、後固定、埋め込み、セクショニング、および対比

1. 1.6 mLの一次固定液(0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH 7.3)中の2.5%グルタルアルデヒド)を2 mLマイクロ遠心チューブで調製します。5°Cで最大14日間保管してください。
2. 筋生検または全筋肉から、任意の方向に最大直径が1 mmで、断面よりも縦方向の繊維方向に少し長い小さな標本を分離します(配向目的)。
3. 冷たい一次固定溶液が入ったチューブに試料を置きます。5°Cで24時間保存してください。
4. 試料を0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH 7.3)で4回(各洗浄の間に15分)洗浄します。トランスファーピペットを使用して、使用済みのバッファーをチューブから取り出し、標本をそのままにして、新しいバッファーを追加します.
   手記：最終洗浄後、試料は5°Cの0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液に数ヶ月間保存できます。ここでプロトコルを一時停止できます。
5. 1% 四酸化オスミウム (OsO₄) と 1.5% フェロシアン化カリウム (K₄Fe(CN)₆) を 0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.3) に 4 °C.
   で 120 分間塗布 手記：1.5%フェロシアン化カリウム(K₄Fe(CN)₆)の使用は、グリコーゲン粒子の最適なコントラストに不可欠です。
6. 室温(RT)の再蒸留水で2回すすいでください。
7. 次の濃度を使用して、RTで段階的な一連のアルコール(エタノール)に浸すことにより脱水します:70%(10分)、70%(10分)、95%(10分)、100%(10分)、および100%(10分).
   手記：各ステップで、試料はエタノールに浸され、その後、試料の乾燥を避けるために部分的にのみ除去されます。最後に、残ったエタノールは廃棄されます。
8. 次の体積比(プロピレンオキシド/エポシディ樹脂)を使用して、プロピレンオキシドとエポシジン樹脂の等級付け混合物をRTで浸透させます:1/0(10分)、1/0(10分)、3/1(45分)、3/1(45分)、1/1(一晩)。翌日、試料を100%新鮮なエポシジン樹脂に型に埋め込み、60°Cで48時間重合します。
9. 縦配向繊維の極細(60-70nm)切片を切断し、以下のように1穴の銅グリッドに集めます。
   1. 試料のブロックをウルトラミクロトームホルダーに取り付けます。
   2. ティッシュのレベルに到達するために、かみそりの刃で表面のブロックを切り取ります。
   3. ダイヤモンドナイフ(ウルトラカット45)を試料の前に取り付け、試料表面をナイフと平行に整列させます。
   4. ダイヤモンドナイフで半薄片(1μm)を作製し、サンプルの向きを確認します。半薄切片をトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で観察します。
   5. ブロックをさらにトリミングして関心領域を縮小し、適切な極薄セクションを取得します。
   6. 2本目のダイヤモンドナイフ(ウルトラカット45)で極薄(60-70nm)切片をカットします。
   7. パーフェクトループを使用して、1穴の銅グリッドに1〜2のセクションを収集します.
      手記：1穴の銅グリッドには、中央に1つの穴があり、Formvarの支持膜があります。
10. 上記のグリッドを酢酸ウラニル溶液(0.5%の二蒸留水)に20分間浸し、次にクエン酸鉛溶液(1%の二蒸留水)に15分間浸して、酢酸ウラニルとクエン酸鉛とセクションを対比します。2つの汚れの間と後にグリッドを二重蒸留水で洗浄します。
    手記：ここでプロトコルを一時停止できます。

2. イメージング

1. 透過型電子顕微鏡(加速電圧80kVで駆動)、パソコン、画像記録ソフトの電源を入れます。デジタルスロースキャン2k×2kCCDカメラと関連するイメージングソフトウェアでデジタル画像を記録します。
2. 顕微鏡ステージに複数のセクションを持つグリッドを挿入します。
3. 最初にグリッドを低倍率(x100など)でスクリーニングして、切片(支持膜の穴、破片など)の品質を判断し、最高品質の切片を選択します。低倍率で、筋線維の方向を決定します。
4. 次に、ビームを断面の周辺ファイバーの中心に向け、倍率を上げます。30 kを超える倍率で画像の焦点を合わせ、画像に十分な細部を確保します。これは、利用可能な場合はReal-Time Fast Fourier Transformationによって導かれます。最後に、目的の倍率で1秒の露光時間で画像を記録します。
5. ランダムに選択したファイバーの合計 24 枚の画像、つまり、筋原線維腔の 12 枚の画像と 12 個のサブサルコレマル腔の画像を、10 k から 40 k の間の倍率で取得します。画像がファイバーの長さと幅全体にランダムに分散されていることを確認し、偏りのない結果が得られるようにします (図 1A).
   手記：最適な倍率は、使用可能なカメラの解像度と顕微鏡写真のサイズによって異なります。目標は、グリコーゲン粒子径を1nmステップ以内で測定できる最終分解能を達成し、筋原線維領域の総面積を少なくとも70μm2、繊維の全長を少なくとも25μmの繊維に分配して、筋原線維腔の12枚の画像と12枚の繊維内細胞内空間の画像に分配することである。 それぞれ。ファイバーあたり24枚の画像は、ヒト、ラット、およびマウスの骨格筋の個々のファイバーにおけるグリコーゲンのさまざまなプールの体積含有量の精度(誤差係数)を提供する可能性が最も高いです(図2E)。
6. 手順2.4と2.5を繰り返して、合計6〜10本のファイバーが画像化されます。必要に応じて、追加の切片をカットし(すでに画像化されたファイバーの重なりを避けるために、少なくとも150μm離して)、手順1.9〜2.5を繰り返します。

>3. 画像解析

1. ImageJに画像をインポートするには、[ファイル]>[開く]をクリックします。
2. 画像の元のサイズと一致するようにグローバルスケールを設定するには、[分析]>[スケールの設定]をクリックします。
3. [画像] > [ズーム >] をクリックして 100% ズームインします。
4. Tools(ツール)メニューのStraight(直線)ツールを使用して、筋原線維腔の画像ごとに1枚のZディスクの厚さ(繊維あたり12枚)を測定します(図1D)。6〜10本の繊維のそれぞれの平均Zディスクの厚さを計算します。
5. 最も太い平均 Z ディスクを持つ 2-3 繊維をタイプ 1 繊維として定義し、最も細い平均 Z ディスクを持つ 2-3 繊維をタイプ 2 繊維として定義します。中間の2〜4ファイバーは、さらなる分析のために無視してください(図1E).
   注:サンプルの4〜6本の繊維のそれぞれについて、次の手順を繰り返します。グリコーゲン体積分率は、ポイントカウントによって推定されます。グリッドのサイズは、推定値の十分な高精度を得るために選択されます。これは多くの場合、250 ヒットを達成することで得られ、これにより必要なポイントの総数と、ポイントあたりの面積が決まります。
6. Segmented Lineツールを使用して、軟骨下領域のすぐ下に見える最も外側の筋原線維の長さを測定します(図2A).
   手記：この長さは、表面積あたりのサルコレン下グリコーゲンを発現するために使用されます(すなわち、最も外側の筋原線維の長さに切片の厚さ(60 nm)を掛けたもの);ステップ4.5を参照。したがって、この長さで表される亜サルコレンマル領域のみが分析に含まれます。
[
7. 分析] > ツール] > [グリッド] をクリックしてグリッドを挿入し、[ポイントあたりの面積] を 32,400 nm² に設定します。12の亜石膠腫画像で、クロスが亜飴体グリコーゲンに当たる利用可能な長さ内のヒット数を数えます(図2A)。ヒットとは、クロスの右上隅に存在するグリコーゲン粒子と定義されます。
8. [Analyze Tools > Grid]をクリックしてグリッドを挿入し>ポイントあたりの面積を160,000 nm²に設定します。十字が筋原線維内空間に当たる12枚の筋原線維画像のヒット数を数えます(図2B)。
[
9. Analyze Tools > Grid] をクリックしてグリッドを挿入し>ポイントあたりの面積を 3,600 nm2 に設定します。12枚の筋原線維画像で、クロスが筋原線維内グリコーゲンに当たるヒット数を数えます(図2C)。
[
10. Analyze (分析)] > Tools (分析ツール)] > [Grid] (グリッド) をクリックしてグリッドを挿入し、[Area Per Point] を 32,400 nm² に設定します。12枚の筋原線維画像で、クロスが筋原線維間グリコーゲンに当たるヒット数を数えます(図2D)。
11. [直線] ツールを使用して、12 枚の画像のそれぞれについて、各プールのランダムに選択された 5 つのグリコーゲン粒子の直径を測定し、ファイバーごとにプールあたり平均 60 個の粒子を取得します
    注:平均60個の粒子は、ファイバー内の変動をほぼカバーします(図2F)。

結果

図1:イメージングとファイバータイピング(A)各ファイバーは、ランダムに体系的な順序でイメージングされます。(B)亜石膠細胞空間からの画像の例。(C)筋原線維腔からの画像の例。(D)各筋原線維画像では、1つのZディスクの幅が測定されます(赤い線)。合計 12 枚の Z ディスク (画像ごとに 1 枚) の測定値は、約 0.03 の誤差係数を示します。(E)10回の生検のそれぞれの6〜10本の繊維における平均繊維Zディスク幅の典型的な分布。各生検から、2〜3本の線維がタイプ1およびタイプ2として定義されます 生検内分布に基づいて。画像は、以前の研究に含まれるパワーリフターの外側広筋の生検に由来しています。m:ミトコンドリア、Z:Zディスク。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1,2-プロピレンオキシド	メルク	75勝56敗9分
812レジンミディアムキットの埋め込み	ターブ	T031
グルタルアルデヒド溶液 25%	メルク	1.04239.0250
アイテム	オリンポス		イメージングソフトウェア
ライカEM AC20	ライカ		自動コントラストシステム
OSIS Veletaデジタルカメラ	オリンポス
四酸化オスミウム4%溶液	ポリサイエンス	0972Aシリーズ
フィリップスCM100トランスミッションEM	フィリップス
ヘキサシアノフェレートカリウム(II)三水和物	シグマ・アルドリッチ	455989から245G
ナトリウムカコジルアトバッファー 0.2 M ph 7.4	Ampliqon.com	AMPQ40989.0500
ウルトラミクロトーム ライカ UC7	ライカ
ウルトロステインクエン酸鉛3%、安定化溶液	ライカ	16707235
酢酸ウラニル二水和物	ポリサイエンス	6159-44-0