走査型電子顕微鏡による膜フリル形成の定量化

要約

出典:Ahn, W. et al., 走査型電子顕微鏡を用いた膜フリル形成の可視化.J. Vis. Exp. (2021年度)

このビデオは、走査型電子顕微鏡、SEMを使用して、膜のフリルを表示するマクロファージ細胞のサンプル調製、固定、およびイメージングを示しています。膜の形態と組織に関する詳細な情報は、細胞の生理学的状態を理解するために重要です。

プロトコル

1. 細胞株と細胞培養

1. 37°Cおよび5%_CO2の加湿インキュベーターで、10%(vol / vol)熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100 IU / mLのペニシリン、および100 μg / mLのストレプトマイシンを添加したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)でRAW264.7マクロファージを増殖させます。成長培地は一日おきに交換してください。
2. 細胞が80%コンフルエントになったら、滅菌PBSを使用してプレートを2回洗浄します。
3. 0.5%トリプシン-EDTAを1,000 μL添加して細胞を剥離し、細胞培養プレートを加湿インキュベーター内で37°Cで3〜5分間インキュベー
トします。
4. プレートを光学顕微鏡で観察し、細胞の解離を確認します。10% FBSを含む増殖培地10 mLを添加して、トリプシンを不活性化します。
5. 細胞懸濁液を50 mLのコニカルチューブに集め、400 x gで室温で5分間遠心分離します。細胞を完全細胞培養培地に穏やかに再懸濁し、トリパンブルー(0.4%)染色を使用して細胞数と生存率を測定します。
   手記：この実験で推奨される最小細胞生存率は>90%です。
6. 滅菌ガラスカバースリップをオートクレーブ滅菌鉗子を使用して、24ウェルプレートのウェルに配置します。1 x 10⁶細胞/mLの密度でカバーガラス上に細胞を播種し、プレートを加湿インキュベーターで37°C、5%_CO2で一晩インキュベー
トします。
7. 処理前に、各ウェルの培地を新鮮な500 μLの完全培地と交換してください。マクロファージをビヒクル(DMSOまたはEIPAの溶解に用いる他の溶媒)またはマクロピノサイトーシス阻害剤5-(N-エチル-N-イソプロピル)-アミロライド(EIPA、25μM)で30分間前処理します。
8. マクロピノサイトーシスのビヒクルおよび刺激物質で細胞を処理し、膜の波打つを促進します:ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA、1μM、30分)およびマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、100 ng/mL、30分)
   手記：マクロピノサイトーシスの代替阻害剤[例:ラトランクリンA(1 μM、30分)またはサイトカラシンD(1 μM、30分)]および刺激剤[例:上皮成長因子(EGF、100 ng/mL、10分)または血小板由来成長因子(PDGF、100 ng/mL、15分)]は、マクロファージおよび他の細胞タイプのマクロピノサイトーシスを特徴付けるためにも使用できます。細胞は、マクロピノサイトーシスの生理学的刺激物質による治療の前に、一晩の血清欠乏を必要とする場合があります。.他の細胞タイプのマクロピノサイトーシスを刺激するためには、最も効果的な濃度とインキュベーション時間を決定する必要があることに注意することが重要です。

2. SEMの固定

1. 処理後、ウェルから培地を吸引し、氷冷したPBSでカバースリップを2回洗います。
2. 細胞(0.1 Mカコジル酸ナトリウム中の4%パラホルムアルデヒドと2%グルタルアルデヒド)を室温で30分間固定した後、4°Cで固定液中で一晩インキュベートします。
3. カバースリップを以下の試薬500 μLで、細胞単層を乱さずに穏やかに洗浄し、インキュベートします。
   1. 0.1 Mカコジル酸ナトリウムで1回洗浄し、15分間インキュベートします。
   2. dH₂Oで2回洗浄し、各洗浄で10分間インキュベートします。
   3. 25%エタノールで2回洗浄し、各洗浄で10分間インキュベートします。
   4. 50%エタノールで2回洗浄し、各洗浄で10分間インキュベートします。
   5. 75%エタノールで2回洗浄し、各洗浄で10分間のインキュベーションを行います。
   6. 80%エタノールで2回洗浄し、各洗浄で10分間インキュベートします。
   7. 95%エタノールで2回洗浄し、各洗浄で10分間インキュベートします。
   8. 100%エタノールで2回洗浄します。各洗浄で10分間のインキュベーションを行います.
      手記：試薬の交換/交換は、細胞の空気乾燥を防ぐために迅速に行う必要があります。カバースリップは、100%エタノール中を4°Cで数日間放置できます。長期保存の場合は、100%エタノールを追加し、サンプルの空気乾燥を防ぐためにウェルをパラフィルムで覆います。

3. 臨界点乾燥

1. カバースリップをクリティカルポイントドライヤーに入れ、100%エタノールで覆います。電源ボタンを押して、_CO2タンクを開きます。
2. 温度が0°Cに下がるまでCoolボタンを約30秒間押し、チャンバーウィンドウに気泡が表示されるまでFillボタンを押します。
3. パージ排気からのエタノールの臭いが消えるまで、パージボタンを押します。温度が0°Cに下がるまで、もう一度Coolボタンを押します。
4. FillボタンとPurgeボタンを押してオフにし、_CO2タンクを閉じます。Coolボタンをもう一度押してオフにし、Heatボタンを押します。
5. 温度を42°C、圧力を1,200psiに設定します。圧力と温度が安定したら、ブリードボタンを押して圧力をゆっくりと下げます。
6. チャンバー圧力が150 psiに達したら、ベントボタンを押して、圧力が0 psiに下がるまで待ちます。臨界点乾燥機の電源を切り、カバースリップを取り外します。
7. SEMアルミニウム試料マウントにカバースリップをカーボン接着タブを使用して取り付け、スパッタコーターで金/パラジウムを使用してスパッタコーティングを施します。
8. 電源ボタンをオンにして、掃除機が30mTorrに達するまで待ちます。ガススイッチをオフにし、ファインガスバルブを反時計回りに回して、チャンバーを洗い流し、湿気と空気を取り除きます。
9. 真空度が200mTorrに増加したら、ガススイッチをオフにして、真空度が30mTorrに達するまで待ちます。この手順を 3 回繰り返します。
10. タイマーボタンを押し、ゲージが10mAを示すまで電圧ノブを調整します。コーティングされたカバースリップをチャンバーから取り外します。
    手記：製造元の指示に従って、サンプルの臨界点乾燥とスパッタコーティングを行います。

4. イメージングと定量化

1. サンプルカバースリップを走査型電子顕微鏡のチャンバーに挿入します。ドアを閉めて、Evacボタンを押します。
2. SEM操作ソフトウェアを開きます。加速電圧を15kVに、作動距離を10mmに設定します。
3. 座標ボタンを押し、セルが観察画面の中央に表示されるまでコントローラー内を移動します。倍率を3,500倍に設定し、[写真]ボタンをクリックしてサンプルを画像化します><。 手記：より高い倍率(8,500倍から16,000倍)を使用して、原形質膜をより詳細に表示します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5%トリプシン-EDTA	ギブコ	15400-054
2%グルタルアルデヒド	電子顕微鏡科学	16320
4% パラホルムアルデヒド	サンタクルスバイオテクノロジー	281692
5-(N-エチル-N-イソプロピル)-アミロリド	シグマライフサイエンス	A3085の
カーボン粘着タブ	電子顕微鏡科学	77825から09
ジメチルスルホキシド	コーニング	25-950-CQCの
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム	Cytivaライフサイエンス	01 SH30022月
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC処理マルチウェル細胞培養プレート	隼	353047
ウシ胎児血清	ジェミニバイオ	900-108
HERAcell 150i CO2 インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	51026282
ハマーモデル6.2スパッタコーター	アナテックUSA	58565
JSM-IT500HR 走査型電子顕微鏡
顕微鏡カバーガラス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12-545-82
ペン連鎖球菌	ギブコ	15140-122
ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート	ミリポアシグマ	524400
RAW 264.7マクロファージ	ATCCの	ATCC TIB-71 (英語
組換えヒトM-CSF	ペプロテック	300〜25
Samdri-790クリティカルポイントドライヤー	株式会社トウシミスリサーチ	8778Bの
SEMアルミニウム試料マウント	電子顕微鏡科学	75220
カコジル酸ナトリウム	電子顕微鏡科学	12300
トリパンブルーソリューション	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15250061

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