走査型電子顕微鏡による膜フリル形成の定量化

Abstract

出典:Ahn, W. et al., 走査型電子顕微鏡を用いた膜フリル形成の可視化.J. Vis. Exp. (2021年度)

このビデオは、走査型電子顕微鏡、SEMを使用して、膜のフリルを表示するマクロファージ細胞のサンプル調製、固定、およびイメージングを示しています。膜の形態と組織に関する詳細な情報は、細胞の生理学的状態を理解するために重要です。

Protocol

1. 細胞株と細胞培養

1. 37°Cおよび5%_CO2の加湿インキュベーターで、10%(vol / vol)熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100 IU / mLのペニシリン、および100 μg / mLのストレプトマイシンを添加したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)でRAW264.7マクロファージを増殖させます。成長培地は一日おきに交換してください。
2. 細胞が80%コンフルエントになったら、滅菌PBSを使用してプレートを2回洗浄します。
3. 0.5%トリプシン-EDTAを1,000 μL添加して細胞を剥離し、細胞培養プレートを加湿インキュベーター内で37°Cで3〜5分間インキュベー
トします。
4. プレートを光学顕微鏡で観察し、細胞の解離を確認します。10% FBSを含む増殖培地10 mLを添加して、トリプシンを不活性化します。
5. 細胞懸濁液を50 mLのコニカルチューブに集め、400 x gで室温で5分間遠心分離します。細胞を完全細胞培養培地に穏やかに再懸濁し、トリパンブルー(0.4%)染色を使用して細胞数と生存率を測定します。
   手記：この実験で推奨される最小細胞生存率は>90%です。
6. 滅菌ガラスカバースリップをオートクレーブ滅菌鉗子を使用して、24ウェルプレートのウェルに配置します。1 x 10<....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5%トリプシン-EDTA	ギブコ	15400-054
2%グルタルアルデヒド	電子顕微鏡科学	16320
4% パラホルムアルデヒド	サンタクルスバイオテクノロジー	281692
5-(N-エチル-N-イソプロピル)-アミロリド	シグマライフサイエンス	A3085の
カーボン粘着タブ	電子顕微鏡科学	77825から09
ジメチルスルホキシド	コーニング	25-950-CQCの
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム	Cytivaライフサイエンス	01 SH30022月
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC処理マルチウェル細胞培養プレート	隼	353047
ウシ胎児血清	ジェミニバイオ	900-108
HERAcell 150i CO2 インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	51026282
ハマーモデル6.2スパッタコーター	アナテックUSA	58565
JSM-IT500HR 走査型電子顕微鏡
顕微鏡カバーガラス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12-545-82
ペン連鎖球菌	ギブコ	15140-122
ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート	ミリポアシグマ	524400
RAW 264.7マクロファージ	ATCCの	ATCC TIB-71 (英語
組換えヒトM-CSF	ペプロテック	300〜25
Samdri-790クリティカルポイントドライヤー	株式会社トウシミスリサーチ	8778Bの
SEMアルミニウム試料マウント	電子顕微鏡科学	75220
カコジル酸ナトリウム	電子顕微鏡科学	12300
トリパンブルーソリューション	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15250061