微小血管血栓形成を研究するための生体内蛍光顕微鏡

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物の事前配置

1. マウスの体重を量り、それぞれの薬物(例:.、カンナビノイド、5 mg / kg体重(bw)をインスリン注射器にロードします。.血栓誘導の30分前に薬物を投与します。.
2. マウスの首を親指と人差し指で挟み、小指でマウスの尾を挟むことにより、動物を伸ばし、腹部の左下象限に腹腔内(ip)に薬物を注入します。動物をケージに15分間戻します。
3. ケタミン(90 mg/kg bw)およびキシラジン(25 mg/kg bw)で麻酔を準備します。血栓導入の15分前に、マウスに麻酔をかけます。マウスをケージに入れ、尻尾を少し引っ張り、インスリン注射器で麻酔薬ipを注入します。
4. 麻酔が始まるまでマウスをケージに戻します。十分な麻酔を確認するには、鉗子で尾をつまみます。
5. 解凍したフルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン(FITC-デキストラン; 5%, 150 kDa)を0.05 mLをインスリン注射器に入れます。.注射器に充填する際は、(iv)投与される小さな気泡でも動物にとって致命的となる可能性があるため、気泡が残っていないことを確認してください。
6. 麻酔をかけたマウスを加熱プレートの上に伏せて置きます。加熱プレートを37°Cに調整します。
7. マウスの角膜に目の軟膏を塗ります。皮膚を消毒し、滅菌器具を使用してください。
8. ポリプロピレン7/0の2つの縫合糸を右耳の頭蓋と尾側の端に縫い合わせます。ステッチをできるだけ端に近づけ、ベースにできるだけ近位に配置します(図1B)。
9. マウスを背側の位置にシフトします。接着ストリップを使用して、すべての脚をアクリルガラスプラットフォームに固定します。前歯の下に縫合糸を引っ掛け、縫合糸をアクリルガラスに粘着ストリップで貼り付けて、頭を背屈に配置します。
10. 操作実体顕微鏡の下でプラットフォーム上で動物を移動させます。16倍の倍率を使用してください。

2. 左頸静脈の作製とFITC-デキストランの注入

注:右耳の顕微鏡検査のために、左頸静脈を準備します。

1. メスを使用して、首の左側の皮膚に頭蓋尾方向に5mmの切開を行います。マイクロ鉗子とマイクロハサミで皮下組織を解剖します。ポリエステル8/0縫合糸または電気凝固法で交差血管を結紮します。
2. 血管に触れずに、マイクロ鉗子とマイクロハサミを使用して静脈をその外来から解放します。
3. 準備したインスリン注射器を使用して、蛍光色素を注入します。.静脈を穿孔せずに、マイクロ鉗子で血管壁を慎重につかみます。膨らんだ血管壁をシリンジで貫通し、FITC-デキストランIVを注入します。
4. 綿棒を使用してシリンジを抜いた後、出血を止めます。耳の血液や染料の汚染を避けてください。

>3. 生体内蛍光顕微鏡検査のための右耳の位置

1. ヒーティングプレート上の動物を、ヒーティングプレート用のスロットと耳を位置決めするための高さ0.5cmの平面を備えたアクリルガラス構造に移します。
2. 粘着ストリップを使用して、動物を下向きにして加熱プレートに固定します。比較的強くて凸状の軟骨を耳の付け根、耳の高さ0.5cmの平面(図1B)の横に配置して、耳の頂端部分が平面上に平らに配置できるようにします。
3. 室温の0.9%NaClをアクリルガラス面に1滴加えて、耳の位置を整えます。右耳を、その凹面腹側にあらかじめ配置された縫合糸を下に向けて、0.9%NaClの滴下に置きます。綿棒を使用して、NaClの滴を吸収し、毛細管現象の力で耳面をアクリルガラスに取り付けます。
4. 縫合糸をアクリルガラスにテープで固定し、耳の位置を固定します。
5. 0.9%室温のNaClを耳の凸状背側に1滴加えます。耳に入る基底血管を圧迫せずに、カバースリップ(直径0.5cm)を1枚慎重に耳に当てます。綿棒を使用して、カバーガラスと耳の標的血管との間の距離を最小限に抑えるために、カバーガラスの下からできるだけ多くのNaClを取り除きます。

>4. 右耳の生体内蛍光顕微鏡と血栓誘導

1. FITC-デキストランの可視化のために生体内蛍光顕微鏡を調整します(450 - 490 nm;FT:510;LP:520)。光源として可変の100W水銀ランプを使用します。高解像度の白黒CCDカメラをDVDレコーダーに接続します。
2. 外転した耳が固定された加熱プレートを含むアクリルガラス上の動物を生体内蛍光顕微鏡の机に移します。
3. 20倍の倍率(20倍/0.95の数値絞り)と20%の光強度を使用して、直径50〜60μm、前向性血流が400〜600μm/sの静脈血管を探します。
4. カバーガラスに室温の水を1滴加えると、倍率63倍(絞り63倍/0.95倍)で水に浸すことができます。直径1mmのカニューレが付いたシリンジを使用し、顕微鏡の対物レンズに滴を置きます。カバーガラスと対物レンズに水滴が接触するのに十分な水を追加します。
5. 水滴を塗布した直後に、直径と血流のオフライン測定のために、20%の光強度で血管を20秒間記録し始めます。
6. FITC-デキストランの注射の5分後に血栓誘導を開始します。このためには、光の強度を100%に上げます。
7. 血栓誘導中は、30秒以内に顕微鏡の開口部を2秒間閉じて、血流を確認します。血流が続く場合は、再度開口部を開けてください。血流が止まった場合は、血管を30 s.
   観察してください。 手記： 流れが30秒以上静止している場合、または血液が逆行性に流れている場合、血管は閉塞していると分類されます。オルソグレード血流が再び始まった場合は、開口部を完全に開き、上記のように血管閉塞が発生するまで血栓誘導を続けます。.初期の血栓誘導では、ほぼ連続的な脱射照明を維持するために、血流を確認するために開口部を閉じた時間をできるだけ短くしてください。その後、血栓の成長中に、血管は蛍光の少ない色素で灌流されるため、連続的に観察することができます。
8. 片耳あたり5本の血管を選択して閉塞します。顕微鏡下での血栓誘導の時間を、FITCデキストランの注射後約1時間に制限します。.

図 1.頸静脈の準備 (A) と生体内顕微鏡検査のための耳の配置 (B)。(A)手術用実体顕微鏡を用いて、右頸静脈を作製します。左耳の配置のための縫合糸は、FITC-デキストランの注射前に縫合されます。左頸静脈の以前の解剖からの創傷は、経皮的縫合糸で閉じられています (B)。左耳はポリプロピレン製7/0縫合糸で固定されています。カバースリップは、耳の基底血管を圧迫せずに慎重に配置されます。加熱プレートは、実験全体を通して動物の体温を維持します。