方法論記事

DNA二本鎖切断の分析のための免疫蛍光顕微鏡

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Popp, H. D., et al.DNA二本鎖切断の形成と修復を解析するためのγH2AXおよび53BP1の免疫蛍光顕微鏡法。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、ヒト単核細胞のDNA二本鎖切断部位に局在する特定のDNA損傷応答タンパク質を検出する免疫蛍光顕微鏡法について説明します。タンパク質は特定の一次抗体によって認識され、その抗体は蛍光色素でタグ付けされた二次抗体に結合し、顕微鏡での可視化中に蛍光を発するため、タンパク質を細胞核内の明確な蛍光病巣として可視化することができます。

プロトコル

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人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. サイトスピンの準備

  1. 患者サンプルの単核細胞を含む2つのサイトスピン(すなわち、γH2AX免疫蛍光染色用のサイトスピン1つとγH2AXおよび53BP1複合免疫蛍光染色用のサイトスピン1つ)を、各調製物について1.0 x 105細胞の遠心分離(300 x g、10分)により調製します(図1および2)。

2. γH2AXおよび53BP1免疫蛍光染色

  1. 固定および透過処理:細胞を200 μLの4% PFAで10分間固定します。固定後、ラボ用シェーカーで30 mLのPBSで細胞を3回穏やかに洗浄します。次に、200 μLの0.1%オクトキシノール9で細胞を10分間透過処理します。ラボ用シェーカーで、30 mLの5%ブロッキング溶液で細胞を3回穏やかに洗浄します。細胞を30 mLの新鮮な5%ブロッキング溶液で1時間ブロックします。
  2. 抗体によるインキュベーション
    1. 一方の調製物をマウスモノクローナル抗γH2AX抗体(1:500)でインキュベートし、もう1つの調製物をマウスモノクローナル抗γH2AX抗体(1:500)およびポリクローナルウサギ抗53BP1抗体(1:500)で4°Cで一晩インキュベー
      2. トします。
    2. インキュベーション後、ラボ用シェーカーで5分ごとに30 mLの2%ブロッキング溶液で細胞を3回穏やかに洗浄します。
    3. ブロッキング溶液を取り出し、第1回をAlexa488標識ヤギ抗マウス二次抗体(1:500)でインキュベートし、第2回をAlexa488標識ヤギ抗マウス二次抗体(1:500)およびAlexa555標識ロバ抗ウサギ二次抗体(1:500)で室温で1時間インキュベー
      4. トします。
  3. 封入剤:細胞を入れたスライドをボウルに入れ、ラボ用シェーカーで5分ごとに30 mLのPBSで細胞を3回穏やかに洗浄します。PBSを取り外し、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを含む封入剤で細胞をマウントします。封入剤の上にカバースリップを敷き、気泡が入らないように注意して置いてください。封入剤が硬化するまで少なくとも3時間待ってから、蛍光顕微鏡で細胞を分析します。

>3. γH2AXと53BP1の焦点の解析

  1. 蛍光顕微鏡:DAPI、Alexa 488、Cy3用のフィルターを装備した蛍光顕微鏡を用いて、100倍の対物レンズ倍率でイメージングを行い、細胞核内のγH2AXおよび53BP1病巣を解析します。カメラで画像を記録し、適切なイメージングソフトウェアで画像を処理します。

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結果

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figure-results-1
図 1:サイトスピンを調製するためのデバイス。

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図 2:サイトスピンの調製。各サンプルの2つのサイトスピンを、1.0 x 105細胞を300 x gで10分間遠心分離することにより調製します。1つのサイトスピンはγH2AX免疫蛍光染色に使用され、もう1つのサイトスピンはγH2AXと53BP1の免疫蛍光染色の組み合わせに使用されます。

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
顕微鏡診断用スライドサーモサイエンティフィックER-203B-CE24顕微鏡スライド
メガフュージ 1.0 Rヘレウス75003060卓上遠心分離機
サイトスピンデバイス
蓋ヘレウス76003422マイクロチューブなしで作業するための蓋
Cytoコンテナヘレウス750034162つの円錐形の穴を持つCytoコンテナ
クリップキャリアヘレウス75003414細胞容器とスライドを保持するためのキャリア
サポートインサートヘレウス75003417クリップキャリアを保持するためのサポートインサート
パラホルムアルデヒドシグマ・アルドリッチP6148固定剤
リン酸緩衝生理食塩水シグマ・アルドリッチD8537バランスの取れた塩溶液
ケミブロッカーメルクミリポア2170ブロッキング剤
マウスモノクローナル抗γH2AX抗体 (JBW301)メルクミリポア05-636γH2AX検出用一次抗体
ポリクローナルウサギ抗53BP1抗体 (NB100-304)ノーバスバイオロジカルズNB100-30453BP1 の検出用一次抗体
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibodyインビトゲンA-11001二次抗体
Alexa Fluor 555標識ロバ抗ウサギ抗体インビトゲンA-31572 二次抗体
Vectashield封入剤ベクターラボラトリーズH-1200DNA染色用のDAPIを含有
アクシオスコープ.A1ツァイス490035蛍光顕微鏡
クールキューブ1CCDカメラメタシステムH-0310-010-MSデジタル録画用カメラシステム
ISISソフトウェアメタシステム該当なし顕微鏡ソフトウェア
型 名

再版と許可

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タグ

H2AX 53BP1 DAPI

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