タンパク質中の複数のリン酸化を同定するための核磁気共鳴分光法

要約

出典:Danis, C. et. al., Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins.J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオでは、核磁気共鳴分光法(NMR)技術を使用してタンパク質内の複数のリン酸化を特定する方法を示します。特定のアミノ酸でのタンパク質のリン酸化は、隣接するアミド水素のシールド解除を引き起こし、スペクトルの違いを生じさせます。

プロトコル

1. ^15N、^13C-Tauの生産(図1)

1. ATransform pET15b-Tau 組換え T7 発現プラスミドを BL21(DE3) 大腸菌菌><細胞に 注:最も長い(441アミノ酸残基)タウアイソフォームをコードするcDNAは、pET15bプラスミドのNcoIおよびXhoI制限部位間でクローニングされます。
   1. 50 μlのコンピテントBL21(DE3)細胞を穏やかに混合し、プラスミドDNAのμgあたり1-5 x 10⁷コロニーを形成し、1.5 mLのプラスチックチューブに100 ngのプラスミドDNAを充填します><。 手記：真核生物のcDNA発現のためにコドンの使用が最適化された細菌株は、ヒトタウの産生に必須ではありません。
   2. 細胞混合物を氷上に30分間置き、次に42°Cで10秒間ヒートショックします。チューブを氷の上に5分間戻し、室温のLB(Luria-Bertani)培地1mlを加えます。細菌懸濁液を37°Cで30分間、穏やかに攪拌しながらインキュベー
   トします。
2. 100 μlの細胞懸濁液を接種ループを用いて、100 μg/mlのアンピシリン系抗生物質を含むLB培地の寒天プレートに均等に広げます。
3. 選択プレートを37°Cで15時間インキュベー
トします。
4. 培養ステップに進むまで、選択プレートを最大約2週間、4°Cに保ちます
   注:-80°Cで保存した細菌培養物(50%グリセロール)のグリセロールストックを調製して、後の段階で培養を開始することができます。
5. 1 mL 1 M MgSO₄、1 ml 100 mM CaCl₂、10 ml 100x MEM ビタミン補体 10 mL、100 mg/ml アンピシリン 1 mL を 1 L のオートクレーブ M9 塩 (6 g Na₂HPO₄、3 g KH₂PO₄、0.5 g NaCl) に加えます。
   手記：CaCl₂溶液をM9塩に加えると、白い沈殿物が形成され、すぐに消散します。
6. 15 N、¹³C-完全培地300 mg、¹⁵NH₄Cl 1 g、および¹³C₆-グルコース2 gを10 mLのM9培地に可溶化します。0.2 μmフィルターを使用して同位体溶液をM9培地に直接ろ過滅菌します。
7. 選択プレートからpET15b-Tau形質転換細菌の1コロニーを接種ループを使用して、100μg/mlのアンピシリンを添加した20mlのLB培地に懸濁します。
8. 接種した培地を37°Cで約6時間インキュベートします。
9. プラスチック分光計キュベット内の細菌培養物の10倍希釈の1 mlで600 nm(OD₆₀₀)の光学密度を測定し>ます<。 手記：_OD600に対応する3.0-4.0の細菌培養物の濁度は、飽和成長段階に達したことを示しています。
10. 2 Lの三角プラスチックバッフル培養フラスコに、アンピシリン(最終濃度100 μg/mL)を添加したM9増殖培地1 Lに、飽和LB培養液20 mLを加えます。
11. 培養フラスコを10°C、50rpmに設定されたプログラム可能なインキュベーターに入れます。インキュベーターをプログラムして、翌日の早朝に200 RPMと37°Cに切り替えます。
12. プラスチック製の分光計キュベットで1mlの細菌培養物で_OD600を測定します。OD₆₀₀が約1.0の値に達したら、1 M IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)ストック溶液400 μl(-20°Cに保持)を加えて、組換えタウタンパク質の発現を誘導します。
13. インキュベーションを37°Cでさらに3時間続け、5,000 x gで20分間遠心分離して細菌細胞を回収します。
14. バクテリアペレットを-20°Cで凍結し、精製ステップまで凍結し、必要に応じて長期間凍結します。

>2. ¹⁵N, ¹³C-Tauの精製(図2)

1. オートクレーブ陽イオン交換(CEX)精製バッファーを121°C、15psiで20分間、バッファーを4°Cで保存します。
2. 細菌細胞ペレットを解凍し、プロテアーゼ阻害剤カクテル1x(1錠)およびDNAseI(2,000ユニット)を新たに補充した抽出CEX Aバッファー(50 mM NaPiバッファーpH 6.5、1 mM EDTA)45 mLで完全に再懸濁します。
3. 20,000 psiの高圧ホモジナイザーを使用して細菌細胞を破壊します。3〜4回のパスが必要です。20,000 x gで40分間遠心分離し、不溶性物質を除去します。
4. バクテリア細胞抽出物をウォーターバスを使用して75°Cで15分間加熱します.
   注:数分後に白い沈殿物が観察されます。
5. 15,000 x gで20分間遠心分離し、熱安定性のあるタウタンパク質を含む上清を保持します。
6. 必要に応じて、次の精製ステップまで-20°Cで保存してください。
7. 高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)システムを使用して、5 mL ベッドカラムとして充塡された強分子 CEX 樹脂で陽イオン交換クロマトグラフィーを実施します(図 3 A)。
   1. 流量を2.5 ml / minに設定します。
   2. CEX Aバッファーでカラムを平衡化します
   3. タウを含む60〜70 mLの加熱抽出物をサンプルポンプ、またはシステムに応じてポンプAを使用してロードします。分析用のフロースルーを収集して、タウタンパク質が樹脂に効率的に結合していることを確認します(2.8を参照)。
   4. 280 nmの吸光度がベースライン値に戻るまで、レジンをCEX Aバッファーで洗浄します。
   5. CEX Bバッファー(CEX Aバッファーと1 M NaCl)を徐々に増加させて得られる3ステップのNaClグラジエントを使用して、カラムからタウを溶出します。FPLC を次のようにプログラムします:グラジエントの最初のステップを 10 カラム容量 (CV) の 25% CEX B バッファーにすると 250 mM NaCl に到達し、2 番目のステップを 50% CEX B バッファーに 500 mM NaCl に到達し、3 番目のステップを 2 CV の 100% CEX B バッファーにすると 1 M NaCl に到達します。溶出ステップ中に1.5 mLのフラクションを収集します。
8. 溶出ステップ中に回収したフラクション10 μlをSDS-PAGE(12% SDS-アクリルアミドゲル)およびクマシー染色(図3 A)で分析します。カラムのローディングステップも、10 μlのフロースルーを分析して確認します。
9. タウを含むフラクションを選択し、次のステップのためにこれらのフラクションをプールします。
10. Tauを含むプールフラクションでバッファー交換を行います(図3 B)。
    1. FPLCシステムを使用して、50 mM重炭酸アンモニウム(揮発性緩衝液)中の53 mL G25レジン充填ベッド(26 x 10 cm)の脱塩カラムを平衡化します。
    2. 流速を 5 mL/分に設定し、5 mLの注入ループを介してタウサンプルをカラムに注入します。280 nmの吸収ピークに対応する画分を収集します。
    3. 最初のCEXプールの量に応じて、注入を3〜4回繰り返します。
11. 280 nm のクロマトグラムのピーク面積を使用して、精製されたタウタンパク質の量を計算します (1 mg のタウは 140 mAU*ml に相当)
    手記：280 nmでのタウタンパク質の吸光係数は7,550 ^{M-1 cm-1}です。タウにはTrp残基は含まれていません。
12. すべてのタウ画分をプールします。
13. サンプルを1〜5 mg相当のタウを含むチューブに分注します。これらのチューブは、溶液の量がチューブの容量に比べて小さくなるように選択してください(たとえば、50 mlのチューブに5 mlの溶液
)。
14. チューブキャップに針で穴を開けます。タウサンプルを-80°Cで凍結します。
15. タウサンプルを凍結乾燥します。凍結乾燥されたタウタンパク質は、-20°Cで長期間保持できます。

3. ¹⁵N-タウのin vitroリン酸化

1. 凍結乾燥タウ5 mgを500 μLのリン酸化バッファー(50 mM Hepes·KOH、pH 8.0、12.5 mM MgCl₂、1 mM EDTA、50 mM NaCl)に溶解します。
2. 2.5 mM ATP (-20 °Cに保存した100 mMストック溶液25 μl)、1 mM DTT (-20°Cに保存した1 Mストック溶液1 μl)、1 mM EGTAチップ(0.5 Mストック溶液2 μl)、1x プロテアーゼ阻害剤カクテルカクテル(1 錠剤を1 mLリン酸化バッファーに溶解して得られた40倍ストック25 μl)および1 μM活性化His-ERK2 (250 μl) を添加してください。保存バッファー 10 mM Hepes、pH 7.3、1 mM DTT、5 mM MgCl₂、100 mM NaCl、および 10% グリセロール、-80 °C) で、総サンプル容量 1 mL.
   手記：活性化されたHis-ERK2は、MEKキナーゼによるリン酸化により社内で調製できます。
3. 37°Cで3時間インキュベートします。
4. サンプルを75°Cで15分間加熱し、ERKキナーゼを不活性化します。
5. 20,000 x gで15分間遠心分離し、上清を収集して保管します。
6. 1 mL サンプルに適した 3.45 mL G25 レジン充填ベッド(1.3 x 2.6 cm)のカラムを使用して、タンパク質サンプルを 50 mM 重炭酸アンモニウムに脱塩します。
7. 2.5 μlのタンパク質サンプルで12% SDS-PAGEを泳動し、その完全性と効率的なリン酸化の両方を確認します(図4)。
8. リン酸化タウサンプルを凍結乾燥します。粉末は-20°Cで保存してください。

4. NMRスペクトルの取得(図5)

1. 凍結乾燥した¹⁵N、¹³C ERK-リン酸化タウ4 mgを400 μl NMRバッファー(50 mM NaPiまたは50 mM重水素化Tris-d11)に可溶化します。Cl、pH 6.5、30 mM NaCl、2.5 mM EDTA、および 1 mM DTT)。
2. NMR分光計のフィールドロック用に5% D₂Oを添加し、内部NMRシグナルリファレンスとして1 mM TMSP(3-(トリメチルシリル)プロピオン-2,2,3,3-d₄酸性ナトリウム塩)を添加します。完全プロテアーゼ阻害剤カクテルの40倍ストック溶液10 μlを添加します。
3. 長い針またはパスツールピペット付きの電子シリンジを使用して、サンプルを5 mm NMRチューブに移します。プランジャーを使用してNMRチューブを閉じます。プランジャーの動きによってプランジャーと液体の間に閉じ込められた気泡をすべて取り除きます。
4. NMRチューブをスピナーに入れます。使用するNMRプローブヘッドに適したゲージでスピナーの垂直位置を調整し、サンプル溶液のほとんどがNMRコイルの内側に入るようにします。
5. 気流を開始します:マグネット制御システムウィンドウでリフトをクリックします。チューブをマグネットボア上部の気流に入れた状態でスピナーを慎重に配置します。エアフローを停止し(クリックリフト)、チューブを磁石のプローブヘッド内の所定の位置に下降させます。
6. 温度を 25 °C (298 K) に設定します。
7. プローブヘッドの半自動チューニングとマッチングを実行して、電力伝送を最適化します。コマンドラインに atmm と入力します。
8. 重水素チャネルに記録されたサンプルのD₂O信号を使用して、分光器の周波数をロックします。マグネット制御システムウィンドウでロックをクリックします。
9. シミング手順を開始して、サンプルの位置での磁場の均一性を最適化します。コマンドラインでtopshim guiと入力して、shimウィンドウを開きます。シムウィンドウで「開始」をクリックします。残留 B0 標準変動値をチェックして、シムが最適であることを確認します (2 Hz 未満が適切です)。
10. 陽子スピンの90°回転を得るために必要なp1パラメータ(陽子無線周波パルスの長さ(μsec))を較正します。水陽子の1Dスペクトルを使用して360°パルスを目指します(図6)。
11. o1パラメータ(Hz)を1Dスペクトルの陽子水周波数に設定して、周波数オフセットを調整します(図6)。
12. 1Dプロトンスペクトル(水信号抑制のためのウォーターゲートシーケンスを含むパルスシーケンス、zggpw5など)の取得を開始して、サンプルからの信号を確認します(図7)。スキャンの回数を相対的なタンパク質濃度に合わせます。コマンドラインに「zg」と入力して、集録を開始します。

結果

図1:組換えタンパク質生産と同位体標識の主なステップのスキーム。 細菌の形質転換から組換えタンパク質産生までのステップは、プロトコルのパラグラフ1に記載されているように概説されています。

図2:組換えタウタンパク質精製の主なステップのスキーム。 細菌細胞溶解から組換えタンパク質精製までのステップは、プロトコルのパラグラフ2に記載されているように概説されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
pET15B 組換え T7 発現プラスミド	Novagen	69257	は -20°C
BL21(DE3) 形質転換能力のある大腸菌	ニューイングランドバイオラボ	C2527I	-80° に保ちます。C
オートクレーブ LB ブロス、レノックス	DIFCO	240210	細菌増殖培地
MEM ビタミン 100X	シグマ	58970C	細菌増殖培地 サプリメント
15N、13C-ISOGRO 完全培地粉末	シグマ	608297	細菌増殖培地 サプリメント
15NH4Cl	シグマ	299251	同位体
13C-グルコース	シグマ	389374	同位体は4°で維持します。C
プロテアーゼ阻害剤錠剤	ロシュ	5056489001	1mlに1錠は、-20°に保つことができる40倍溶液です。C
DNaseI	EUROMEDEX	1307	-20° に保ちます。C
ホモジナイザー(EmulsiFlex-C3)	AVESTIN		Lysisは4°で実現されています。C
PierceTM 未染色タンパク質MWマーカー	Pierce	266109
活性ヒトMEK1キナーゼ、GSTタグ付き	Sigma	M8822	-80°C
AKTÄ純クロマトグラフィーシステム	GE Healthcare		FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 mL カラム)	GE Healthcare	17-5156-01	陽イオン交換クロマトグラフィーカラム
HiPrep 26/10 脱塩	GE Healthcare	17-5087-01	タンパク質脱塩カラム
PD MidiTrap G-25	GE Healthcare	28-9180-08	タンパク質脱塩カラム
Tris D11, 97% D	コルテクネット	CD4035P5	重水素化 NMR バッファー
5 mm 対称マイクロチューブ SHIGEMI D2O ( 内側 & #38 5 個セット)	エウリソトップ	BMS-005B	NMR 茂見チューブ
eVol キット-電子シリンジ スターターキット	コルテクネット	2910000	ピペッティング
ブルカー 900MHz AvanceIII 三重共鳴極低温プローブヘッド	ブルカー		NMR 分光計データ取得用
Bruker 600MHz DMX600 三重共鳴極低温プローブヘッド付き	Bruker		NMR分光計