DNA-タンパク質相互作用を研究するための円二色性分光法

要約

出典:Arya, V., et al. CD分光法でDNA-タンパク質相互作用を研究します。J. Vis. Exp. (2022年)。

このビデオは、ATP依存性クロマチンリモデリングタンパク質の存在下でDNAに起こるコンフォメーション変化を研究するための円二色性(CD)分光法を示しています。ATP加水分解の存在下と非存在下で測定されたCDスペクトルの変化は、結合したDNAのコンフォメーション変化を誘導するリモデラーの能力におけるATPの重要性を示しています。

プロトコル

1. 反応成分の使用濃度

1. CD用バッファーの使用濃度を新たに調製し、反応を調製する前に4°Cに保ちます
   手記：この論文で説明したCD反応の成分の使用濃度は、リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)1 mM、ATP 2 mM、DNA 500 nM、タンパク質1 μM、MgCl₂ 10 mM、EDTA 50 mM、ADAADiN 5 μMです。

2. CDキュベットの選び方と準備

1. 透明度の高いクォーツキュベットでCDスペクトルを収集します。長方形または円筒形のキュベットを使用してください.
   手記：CD石英キュベット(公称容量0.4 mL、光路長1 mm)を、この論文で説明したすべての反応に使用しました。
2. キュベット洗浄液を使用してキュベットを洗浄します。1%キュベット洗浄液を水に加えて400μLの溶液を作り、キュベットに注ぎ、37°Cで1時間インキュベー
トします。
3. キュベットを水で数回洗って、キュベットを清掃します。キュベット内の水またはバッファーをスキャンして、きれいかどうかを確認します.
   手記： 水またはバッファーは、0〜1 mdegの範囲で読み取り値を提供する必要があります。

3. タンパク質とDNAオリゴヌクレオチドの調製

1. 反応中のタンパク質の量を50 μL未満に保ち、あいまいなピークの形成を引き起こすことがあるバッファー成分の量を最小限に抑えます。分解を避けるために、実験中はタンパク質を氷の上に置いてください。
2. 反応にはPAGE精製DNAオリゴヌクレオチドを使用してください.
   手記：ここで説明する反応では、DNAを天然型と熱冷却型(高速冷却(FC)および低速冷却(SC))の両方で使用しました。急速な冷却はDNAの分子内結合を促進し、より多くの二次構造を生み出します。対照的に、ゆっくりと冷却すると、DNA内の分子間結合が促進され、二次構造が少なくなります。
3. 急速冷却するには、DNAを加熱ブロックで94°Cで3分間加熱し、すぐに氷上で冷却します。ゆっくりと冷却するには、DNAを94°Cで3分間加熱し、1分あたり1°Cの速度で室温まで冷却します。

>4. ベースラインスペクトルを記録するための対照実験の設定

1. すべての反応液で反応量を300μLに保ちます。次のように、1.5 mL遠心分離チューブに合計5つのベースライン反応を1つずつ設定します:i)バッファー+水;ii)バッファー+ MgCl₂ + ATP +水;iii)緩衝液+ MgCl₂ + ATP +タンパク質+水;iv) iii + EDTA または ADAADiN;v)バッファー+タンパク質+水。

5. CDスペクトルを記録するための実験の設定

1. 次のように、1.5mLの遠心分離チューブに合計5つの反応を1つずつ設定します:i)バッファー+ DNA +水;ii)バッファー+ DNA + MgCl₂ + ATP +水;iii)緩衝液+ DNA + MgCl₂ + ATP +タンパク質+水;iv) iii + EDTA または ADAADiN;v)バッファー+ DNA +タンパク質+水。

6. スキャンの記録

1. ガスを入れ、CD分光計のスイッチを入れます。
2. 10〜15分後にランプを点灯し、ウォーターバスのスイッチを入れ、ホルダーの温度を37°Cに設定します。
3. CD Spectrumソフトウェアを開きます。
   1. 温度を37°Cに設定します。
   2. 波長範囲を180〜300nmに設定します。
   3. ポイントあたりの時間を 0.5 秒に設定します。
   4. スキャン番号を5に設定します。
   5. Pro-Data Viewerをクリックし、新しいファイルを作成し、実験と日付の詳細で名前を変更します。
4. 劣化を避けるために、すべての反応成分を氷の上に保ちます。ベースラインと反応を1つずつ遠心チューブで作成し、ピペッティングで混合します。反応混合物をキュベットに慎重に移し、気泡がないことを確認します。
5. タイムコース実験を行う場合は、反応を37°Cで必要な時間インキュベートし、スキャンを行い、DNA、ATP、Mg⁺²、およびタンパク質を含むバッファーにEDTAを添加して、ATP加水分解を停止します。
6. EDTAの濃度とそのインキュベーション時間を増やして、ATPase活性を完全に阻害します。
7. ソフトウェア内の対応する反応からベースラインを差し引きます(たとえば、ベースライン1から反応1を差し引きます)。CDスペクトラムソフトウェアまたはデータプロットソフトウェアでデータを平滑化します。データプロットソフトウェアでデータをプロットします.
   手記：対応する反応からベースラインを差し引くと、DNAのみの正味CDスペクトルが得られます。

>7. データの分析と解釈

1. eq (1) で与えられる式を使用して、ミリ度で得られた値を平均残基楕円率に変換します。
   
   ここで、SはCDシグナル(単位:mm)、CはDNA濃度(単位:mg/mL)、mRwは平均残基質量、lは光路長(単位:cm)です。
2. データプロットソフトウェアを使用して、波長と平均残基楕円率に対するグラフをプロットし、ピークを分析します。
3. グラフをプロットするには、Y軸に平均残基楕円率、X軸に波長を選択し、直線グラフをプロットします。
   手記： このグラフは、さまざまな形態のDNAの特徴的なピークを提供します。ピークに対応するDNAの形態は、既存の文献を使用して特定できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アデノシン5′-三リン酸二ナトリウム塩水和物	シグマアルドリッチ	A2383 (英語
CDクォーツキュベット	スターナ	21-Q-1
Chirascan V100 CD分光計	応用光物理学	利用できません
EDTA二ナトリウム塩二水和物	SRLの	43272
ヘルマネックスIII洗浄液	ヘルマ	9-307-011-4-507
塩化マグネシウム六水和物	フィッシャーサイエンティフィック	M33-500
リン酸二塩基性無水ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	S374-500
リン酸ナトリウム一塩基性一水和物	フィッシャーサイエンティフィック	S369-500
Synergy HT マイクロプレートリーダー	ビオテック	利用できません
トリスベース	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-500

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