ラマン分光法を用いた直接免疫測定法による特異的抗原検出法

要約

出典: Hanson, C., et al. Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform. J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオでは、特定の標的抗原を検出するためのラマン分光法に基づく直接免疫測定法について説明します。ラマンプローブに付着した金ナノ粒子の表面に吸着した抗体は、標的抗原と相互作用して特異的なラマンスペクトルを生成し、その後検出されます。

プロトコル

1. UV-Vis/ラマンプローブの準備

1. 裸のAuNP溶液を調製
   1. AuNPの2 ml溶液を、1 mlあたり約1 x 1011粒子の濃度で調製します。
      1. AuNPを濃縮する必要がある場合は、低結合の遠心チューブに2,000 μlのAuNPストックを充填し、5,000 x gで20分間、または上清が透明になるまで遠心分離します。AuNPペレットを乱さないように注意しながら、ピペッティングで上清を取り除きます。
      2. 残りのAuNP溶液を1つのチューブに結合し、UV-Vis測定値を取得し、値を既知の濃度と比較することにより、これは線形関係であるため、濃度を推定します。
2. 適切なラマンレポーターのラベル付け比率を決定する
   1. メタノールに溶解したラマンレポーターの作業溶液を調製します。この濃度は、使用するレポーターによって異なります。この研究では、3,3'-ジエチルチアトリカルボシアニンヨウ化物(DTTC)を200μMの作業溶液で調製します。
   2. 各ウェルの最終容量を 100 μl と仮定すると、96 ウェルプレートの 1 列目の各ウェルに十分な量の作業レポーター溶液を添加し、ラマンレポーターの濃度が 0.2 μM から 10 μM になるようにします。容量が 80 μl になるように各ウェルに十分な HPLC グレードの水を加えます。各ウェルに 20 μl の AuNP を加えて最終容量を作成します各ウェルに100μl。例を表 1 に示します。
   3. プレート読み取りUV-Vis分光光度計を使用して、400〜700nmのUV-Visスペクトルを測定します。適切な濃度は、UV-Visスペクトルのピークが定義された最高濃度です。ラマンレポーターとAuNPの濃度比が最も高いことがわかるまで、濃度を上げながらステップ2.2.2を繰り返します
      手記： 染料とAuNPの形状、サイズ、および製造業者は、適切な濃度に影響を与えます。したがって、リストされている手順は、使用するコンポーネントに応じて評価および変更する必要があります。このプロトコルには、正に帯電した色素の使用が含まれていました。そのため、負に帯電したAuNPを使用することで、AuNPとレポーター間の結合が改善されました。これは、クエン酸キャップAuNPを使用して行われました。詳細については、ディスカッションのセクションを参照してください。
3. ラマンレポーターとPEG-AbをAuNPに縛り付ける
   1. AuNPとラマンレポーターの1.5 mLバッチを2回、あらかじめ決定した濃度で調製し、ラマンレポーターを室温で30分間AuNPに結合させます。
   2. PEG化抗体(PEG-Ab)をAuNPおよびラマンレポーター溶液の1つのバッチに添加して、抗体と粒子の比率を200:1にします。このソリューションは、テストサンプル用です。別の微量遠心チューブで、PEG化抗原を他のバッチのAuNPおよびラマンレポーター溶液に、抗体と粒子の比率が200:1で加え、コントロールとして使用します。溶液を室温で30分間インキュベートします.
      注:抗体と粒子の比率は、使用するAuNPと色素に固有であり、個々のケースごとに最適化する必要があります。ここでの目標は、AuNPプローブが結合する抗体の比率を最も高くし、粒子の凝集を防ぐことです。次の式を使用して、加算する適切な体積を決定します。
      
      ここで、Vは容量、Cはmlあたりの粒子または抗体で表される濃度です。最終容量は約1.5mlである必要があります。
4. AuNP表面の残りのサイトをmPEG-SHでブロックします。
   1. mPEG-SHは、固体メトキシポリエチレングリコールチオールを水を用いて200μM濃度に溶解して調製します。mPEG-SHが完全に溶解するまで溶液をボルテックスします。
   2. ステップ2.3で作成したAuNP-PEG-Ab溶液にmPEG-SHを40,000:1の比率で追加します。溶液を室温で10分間インキュベートし、金ナノ粒子の残りの部位がブロックされていることを確認します。次の式を使用して、加算する適切な体積を決定します。
      
      ここで、Vは容量、Cはmlあたりの粒子または抗体で表される濃度です。最終容量は約1.5mlである必要があります。
5. 機能化されたラマンプローブを回収します。
   1. 粒子を5,000 x gで低結合遠心チューブ内で20分間、または上清が透明になるまで遠心分離します。AuNPsを乱さないように注意しながらピペッティングして上清を取り除きます。
   2. 以前に調製した1x PBS溶液1 mLで粒子を再懸濁します。少量の溶液(3 μl)のUV-Vis測定を行い、その結果を既知のAuNP濃度の測定値と比較することにより、AuNP濃度を推定します。最終溶液が1 x 10¹¹粒子/ml以上になるように容量を調整します。
   3. 溶液は、イムノアッセイプレートの官能基化に使用されるまで4°Cで保存してください。1週間以内に解決策を使用してください。

テーブル 1.DTTC希釈例。DTTCのさまざまな希釈と、関連する量のストックDTTC、金ナノ粒子溶液、および水。

の 名 % 名 % 名 % 名 名 名 % 名 名 % 名 名 名

	各成分の追加量(ml)
DTTC最終濃度(mM)	DTTCワーキングソリューション(200 mM)	AuNP	水
0.2	0.1	20	79.9
0.6	0.3	20	79.7
1	0.5	20	79.5
2	1.0	20	79
5	2.5	20	77.5
7	3.5	20	76.5
10	5.0	20	75

2. イムノアッセイプレートの準備

1. 目的の抗原をイムノアッセイプレートに結合します。
   1. ポリスチレンウェルを満たすのに十分な希釈抗原(50 μg/ml)を調製します。溶液をボルテックスし、すぐに溶液をプレートウェルに加えます。抗原をプレートに室温で1時間結合させます。
2. 結合していない抗原を洗い流します。
   1. 余分な抗原溶液を廃棄容器に捨て、ペーパータオルで覆われた卓上にプレートをぶつけて、余分な抗原溶液を取り除きます。
   2. TBSTをウェルに追加して表面を洗浄し、前述したのと同じ方法で洗浄液を取り除きます。この手順をさらに 2 回繰り返します。
3. プレート上の残りの結合部位をブロックして、非特異的結合を防ぎます。
   1. プレートの各ウェルに70 μlのHSAブロッキング溶液を加え、室温で30分間インキュベートします。
   2. 手順3.2で指定されているのと同じ手順を使用して、プレートを取り外してすすぎます。プレートを覆い、さらに使用する準備ができるまで4°Cで乾燥させて保管します。
4. イムノアッセイプレートを官能基化します。
   1. セクション2で調製したプローブナノ粒子70μlを96ウェルプレートの1本目のカラムに加え、1:2の段階希釈で後続のカラムを希釈します。プレートを少なくとも1時間インキュベートします。イムノアッセイプレートの調製方法の例を図1に示します。
   2. ステップ3.2で詳述したTBSTでプレートを5回洗浄し、AuNPを適切に廃棄するようにしてください。最終洗浄後、各ウェルに1x PBSを70 μl加え、プレートシールで覆います><。 注:コントロールサンプルは透明である必要があります。非特異的結合が発生した場合、コントロールサンプルはテストサンプルと同様の色になります。
5. UV-Visおよびラマン分光法によるアッセイ感度のテスト。
   1. 各ウェルについて、プレート読み取りUV-Vis分光光度計を使用して、400〜700nmの範囲のUV-Visスペクトルを測定します。
   2. 倒立ラマン顕微鏡を使用して、AuNPプローブがあるウェルの表面に対物レンズの焦点を合わせます。井戸のラマンスペクトルを取得します。1,800 ^cm-1 から 400 ^cm-1 の範囲のスペクトルを収集します。すべてのウェルに対してこの手順を繰り返します。
   3. 適切なスペクトルソフトウェアを使用して、ラマンスペクトルの11^次多項式ベースライン補正とUV-Visスペクトルの3次多項式補正を実行します。
   4. 適切なスペクトルソフトウェアを使用して、ラマンスペクトルとUV-Visスペクトルを正規化します。最大値を 1 に設定し、他のすべての値をそれに応じてスケーリングします。ラマンスペクトルを正規化するには、一意のポリスチレンピークを選択して1に設定し、他のすべての値をそれに応じてスケーリングします。
   5. 適切なスペクトルソフトウェアを使用して、各スペクトルのピーク積分を実行します。ラマンスペクトルの場合、ラマンレポーターを表すピークは、ポリスチレンピークがない領域にある必要があります。ピーク積分を実行するには、目的のピークの積分境界を指定し、コントロールを含むすべてのサンプルの目的のピーク面積を記録します。
   6. 対象の平均ピーク面積を AuNP 濃度の対数の関数としてプロットし、各ポイントのエラーバーは関連する標準偏差を示します。これらのキャリブレーションポイントを4パラメータのロジスティックカーブに適合させます。
   7. ブランクサンプルの対象ピークの面積を平均化することにより、ブランクの平均値を決定します。これらの領域の標準偏差を求めます。これはブランクの標準偏差です。
   8. 前のステップで分析したのと同じピークについて、最も低い濃度のピーク面積の標準偏差を求めます。
   9. 「代表結果」セクションで指定されているブランクの限界と検出の下限を計算します。これらの値を4PL検量線とともに使用して、AuNP濃度の観点からLLODを決定します。

結果

図 1.調製したイムノアッセイプレート。調製したイムノアッセイプレートの画像。行AからEはテストサンプルで、行FからHはコントロールサンプルです。カラム1には希釈されていないナノ粒子が含まれており、後続の各カラムにはAuNPプローブの濃度が半分です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
60 nm金ナノ粒子	テッド・ペラ社	15708-6	これらは、クエン酸をキャップした金ナノ粒子です。ラマンレポーターとAuNP表面電荷の関係と、AuNPおよび/またはラマンレポーターの適切な選択への影響については、ディスカッションを参照してください。
炭酸水素ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	S233-500
メタノール	Pharmco-Aaper	3390000000
トリス緩衝生理食塩水(10倍)pH 7.5	サイテック	TBD999の
ボトルトップろ過ユニット	VWRの	97066-202
Tween 20 (ポリソルベート 20)	サイテック	TWN500	洗浄工程の乳化剤として使用されます。
リン酸緩衝生理食塩水 10x 濃縮液、pH 7.4	サイテック	PBD999
プロテインローバインドチューブ 2.0ml	エッペンドルフチューブ	22431102	LoBindチューブは、タンパク質とAuNPがチューブの表面に結合するのを防ぎます。
プロテインローバインドチューブ0.5 ml	エッペンドルフチューブ	22431064	LoBindチューブは、タンパク質とAuNPがチューブの表面に結合するのを防ぎます。
マイクロプレートデバイス UniSeal	GEヘルスケア	〒7704-0001	機能化プレートのシールと保管に使用されます。
アッセイプレート、低蒸発蓋付き、96ウェル平底	共演者	3370
HPLCグレードの水	シグマ・アルドリッチ	270733から4L
3,3′-ジエチルチアトリカルボシアニンヨウ化物(DTTC)	シグマ・アルドリッチ	381306から250MG	ラマンレポーター
mPEG-チオール、MW 5,000 - 1グラム	レイサンバイオ株式会社	MPEG-SH-5000-1グラム
OPSS-PEG-SVA、5,000 MW - 1グラム	レイサンバイオ株式会社	オプスペグ-SVA-5000-1g	OPSS-PEG-SVA には NHS エンドがあります。
マウスIgG、全分子制御	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31903	抗原
ヤギ抗マウスIgG (H+L) 交差吸着二次抗体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31164	抗体
ヒト血清アルブミンブロッキングソリューション	シグマ・アルドリッチ	A1887-1Gの	代わりにウシ血清アルブミンを使用できます。
UV-Vis分光光度計	サーモサイエンティフィック	ナノドロップ2000c
UV-Vis分光光度計	ビオテック	シナジー2
自社製785nm倒立ラマン顕微鏡ユニット	該当なし	該当なし	倒立ラマン顕微鏡は、ウェルプレートの表面に適切に焦点を合わせるのに最適です。それ以外の場合は、96ウェルプレートの高さのために非常に低い倍率が使用されます。ベンダーから購入するよりも安価であるため、自社で構築したシステムを使用しました。ただし、市販の倒立ラマン顕微鏡システムであれば、いずれでも使用することができます。