髄膜炎菌性髄膜炎を誘発するためのマウスモデルへの髄膜炎菌の槽内送達

要約

出典:Pagliuca, C., et al., 腸内送達によるマウスにおける髄膜炎菌性髄膜炎血清群Cの誘導。

このビデオでは、髄膜炎感染を生成するためのマウスモデルへの髄膜炎の腸内送達を実演します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウスの槽内注射

>注:無菌状態を維持するために、すべての手順が層流キャビネットで実行されます。

1. 特定の病原体を含まない条件下でのハウス実験用マウス(8週齢、雌のBalb / c)。食品ペレットと水を自由自在に提供します。
2. 実験を開始する前に、動物を新しい環境に1週間落ち着かせます。
3. 実験を始める前に、体温を量り、評価してください。
   手記：生後8週齢の近交系Balb/c雌マウスの平均体重は約19gです。実験用マウスの平均温度は生理学的に36〜38°Cの範囲です。
4. 首から動物を首筋にし、腹部を70%エタノールで洗浄し、感染の約2〜3時間前に、25G針0.5mm×16mmを使用して、マウス腹部の右下象限にi.p.鉄デキストラン(1%リン酸生理食塩水緩衝液、250mg / kgに溶解)を注入します
   手記：腹腔内注射は、膀胱、盲腸などの腹部臓器の損傷を避けるために、マウス腹部の右下象限で行われました。感染前に鉄デキストランの形で外因性鉄源を動物に投与すると、宿主での細菌増殖が促進されます。.
5. 2〜3時間後、ケタミン(50 mg / kg)とキシラジン(3 mg / kg)、および眼科用潤滑剤を使用して動物麻酔を行います。
6. つま先をつまんだときに痛みの反応がないことを確認して、麻酔の深さを確認します。
7. マウスを胸骨の褥瘡に配置し、手足と頸椎を慎重に伸ばして、脊柱をまっすぐな位置に保ちます。
8. 30 G針x 8 mmのシリンジをロードする前に、細菌懸濁液を穏やかに混合して一貫した懸濁液を維持します<> 手記：細菌懸濁液を注入時間にできるだけ近づけて調製します。その間、室温で保管してください。
9. 解凍後の細菌力価(CFU/mL)に基づき、感染する動物の総数(動物数当たりのCFU細菌量)に対して、使用するCFUの合計の計算を進めます。バイアルから採取する正確な量の計算を進めて、解凍後の細菌力価(CFU / mL)とn匹のマウスの感染に有用な総CFU(解凍後の細菌力価CFU:ml =総CFU:x)の割合を適用して、総CFUを取得します。感染する動物の総数に対する最終的な量を設定します。
   手記： これらの実験では、動物あたり10⁴から10⁹までの幅広い力価を使用しました。
10. 70%エタノールで手術部位を洗浄します。
11. 針を使用して注入点を特定し、髄膜炎菌(野生型株および同遺伝子変異株)、またはコントロールとして鉄デキストラン(5 mg / kg)を補充したGCブロスの確立されたCFUを、30 G針x 8 mmを使用して、後頭バリ穴を通してマウスの槽マグナに合計10 μLで注入します。
    1. 頭蓋頸部接合部、特に背側くも膜下腔に針を配置することにより、槽の接種を行います。Ventroflexは、このスペースをアクセス可能にするためのヘッドです。
    2. 簡単に言えば、動物を横臥位に置き、耳を邪魔にならないように持ち、首を適度に(90〜100°)曲げます。首と頭の正中線(鼻から後頭部まで)がテーブルトップと完全に平行な位置にあることを確認します。
    3. アトラスの翼に触れて、軸方向の回転をなくすために、それらが重なっていることを確認します。自然なくぼみは通常、針が後頭部の穴に入る可能性が最も高い正中線に触れることができます。
    4. マウスにナイセリアを注射した後、注射器と針を安全に廃棄してください。.
12. 動物をケージに入れ、目覚めて動きが完全に回復するのを待ちます。
13. 感染したマウスのいるケージは、層流キャビネットの下に保管してください。
14. 感染後24時間で、昏睡スケールに従って昏睡の臨床徴候がないかマウスを監視します。昏睡スケール:1 =昏睡状態、2 =仰向けになった後、直立しない、3 = 30秒以内に直立、4 = 5秒以内に直立、最小限の歩行活動、5 =正常
    手記： 動物で痛みが記録された場合、メロキシカムによる鎮痛剤(研究期間中は5 mg / kg i.p.)が投与されました。.

2. 動物の生存とCFUカウント

1. アニマルサバイバル
   1. 異なる用量(マウスあたり10、⁴から10、⁹ CFUの範囲)で細菌接種物を調製し、i.cist.ルートで動物に感染させます。
   2. 同様に、鉄デキストラン(5 mg / kg)を補充したGCブロスをコントロールマウスに接種します。
   3. 動物の臨床症状を監視します:フリルの毛皮、猫背の外観、低体温、体重減少、無気力、または瀕死の状態を、実験全体を通じて168時間(7日間)、実験期間中は少なくとも1日2回
   。
   4. 毎日、デジタル天秤と直腸体温計を使用して体重と体温を測定します。
   5. マウスの生存を1週間記録する.
      手記：感染後の動物の自然死を記録し、昏睡状態が 2 に達した動物、または 168 時間以上の観察で生き残った動物は安楽死させます。
   6. 昏睡値が2のマウス、または観察時間以上生存したマウスにケタミン(50 mg / kg)とキシラジン(3 mg / kg)で麻酔をかけ、眼軟膏を塗布します。
   7. つま先をつまむことで痛みの反応がないことを確認します。
   8. 子宮頸部脱臼によるマウスの安楽死を行い、統計分析のためにマウスを死亡として記録します。
   9. 感染した動物の動物生存またはCFUカウントアッセイに進みます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アラーム温度計	テストー	9000530	デバイス
BDマイクロファインシリンジ	BDの	320837	U-100インスリン
BD Plastipak シリンジ 1ml 25GA 5/8in	BDの	300014	05×16ミリメートル
BD Plastipak シリンジ 5ml	BDの	308062	07×30ミリメートル
バイオハザードオーラB垂直層流キャビネット	バイオエアs.c.r.l.	オーラB3	デバイス
C150 CO2インキュベーター	バインダー	〒9040-0078	デバイス
Dieteスタンダード証明書	ムセドラs.r.l.	4RF21	動物用食品ペレット
デュモンHPピンセット 5ステンレス鋼	F.S.T. by デュモン	AGT5034	0,10 x 0,06 mmチップ
電子天びん	ジベルティーニ	EU-C1200	最大1200g、d=0.01g、T=-1200g
鉄デキストラン溶液	シグマ・アルドリッチ	D8517-25ミリリットル
ケタミン	インターベット
微生物学安全キャビネット BH-EN and BHG Class II	高 速	BH-EN 2004
微量遠心チューブ 1.5ml	ブランド	PP780751	スクリューキャップPP、グラッド
マウスハンドリング鉗子	F.S.T.	11035-20	鋸歯状ゴム;把持面:15 x 20 mm
天然ラテックス手袋	メディカ	M101
タッチN凝灰岩使い捨てニトリル手袋	アンセル	92〜500
キシラジン	インターベット

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