マウスモデルにおける感染部位における好中球動員動態と細菌負荷のモニタリング

要約

出典:Anderson, L. S., et al. 黄色ブドウ球菌感染に対する自然免疫応答を評価するためのマウスモデル。 J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、GFP発現好中球を持つ免疫不全のトランスジェニックマウスの感染部位での好中球動員ダイナミクスを研究するためのin vivoイメージングを示しています。これは、発光細菌を注入して感染を引き起こすというものです。これにより、感染部位への好中球の動員が起こり、その追跡はイメージングによって行われます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウスのソースとハウジング

1. C57BL/6J遺伝的背景を持つLysM-eGFPマウスを導出します。C57BL/6Jの背景でLysM-EGFPマウスとMyD88^-/-マウスを交配することにより、LysM-EGFP×MyD88^-/-マウスを導出します。
2. ビバリウムの中のハツカネズミ。これらの研究では、動物は手術前にカリフォルニア大学デービス校でグループに分けて飼育され、手術後には1匹飼育されました。10〜16週齢のマウスを使用してください。

2. 細菌の調製と定量

1. 目的の生物発光黄色ブドウ球菌株を-80°Cで保存し、氷上で解凍します。5%ウシ血液寒天培地プレートに縞模様。縞模様のプレートを加湿インキュベーターで37°Cで一晩(16時間)インキュベートします
   手記：このプロトコルでは、ALC2906 SH1000株を使用しました。この株には、ペニシリン結合タンパク質2プロモーターがPhotohabdus luminescens由来のluxABCDEレポーターカセットに融合したシャトルプラスミドpSK236が含まれています。
2. 純水1mLあたり0.03gのTSB粉末を混合してトリプシン性大豆ブロス(TSB)を調製し、TSBをオートクレーブして滅菌します。冷却したら、滅菌技術を使用して必要な抗生物質を追加します。このプロトコールでは、10 μg/mL のクロラムフェニコールを TSB に加えて、生物発光 luxABCDE カセットを含む pSK236 シャトルプラスミドの発現を選択します。
3. 黄色ブドウ球菌プレートから3〜4個の別々のコロニーを10μg/mLクロラムフェニコールを含むTSBに選択し、一晩培養を開始します。インキュベーションシェーカーで37°Cで一晩(16時間)インキュベー
トします。
4. 一晩培養から新しい細菌培養を開始するには、サンプルを10 μg/mLのクロラムフェニコールでTSBに1:50に希釈します。200rpm、37°Cのインキュベーションシェーカーで培養します。
5. 黄色ブドウ球菌を分割してから2時間後、分光光度計で600 nm(OD₆₀₀)の光学濃度を監視します。OD₆₀₀ の時間対時間を測定して、中対数相の成長を見つけます。ALC2906 SH1000株の場合、OD₆₀₀ 0.5 は中対数であり、1 x 10⁸ CFU/mL の濃度に相当します(図 1)。
6. OD₆₀₀が0.5の場合、氷冷したDPBSでバクテリアを1:1で洗います。バクテリアを3,000 x g、4°Cで10分間遠心分離し、上清を慎重にデカントし、冷却したDPBSとボルテックスを十分に加えます。もう一度、3,000 x g、4°Cで10分間遠心分離します。
7. 上清を慎重にデカントします。バクテリアペレットを希望の濃度で再懸濁します。これらの研究では、3 mL の ALC2906 SH1000 を回収し、1.5 mL の PBS に再懸濁すると、細菌濃度が約 2 x 10⁸ CFU/mL と相関します。使用するまでバクテリアを氷の上に置いてください。
8. 細菌濃度を確認するには、細菌サンプル100μLをPBSで1:10,000および1:100,000に希釈します。20 μLのアリコートを寒天プレートにプレートします。加湿インキュベーターで37°Cで16時間インキュベートします。肉眼検査でCFUをカウントし、翌日に細菌濃度を計算します。

3. 黄色ブドウ球菌の皮膚切除と接

種

1. 100 μL の 0.03 mg/mL ブプレノルフィン塩酸塩 (~0.2 mg/kg) を腹腔内注射により各マウスに投与します。
2. 注射後20分で、2〜4匹のマウスを2〜4匹のマウスを2〜3LPM酸素と2〜4%イソフルランの入ったチャンバーに入れます。マウスが完全に麻酔されたら、マウスを一度に1つずつ、2〜3LPM酸素と2〜4%イソフルランに接続されたノーズコーンに移します。マウスが完全に麻酔をかけられていることを確認するには、親指と人差し指で後肢をしっかりとつまみます。動物がピンチに反応しない場合は、次のステップに進みます。
3. 電動バリカンでマウスの背面の1インチ×2インチの部分を剃り、清潔なワイプまたはガーゼを使用して毛皮の切り抜きの領域を取り除きます。脱毛ローションの使用は、過剰な炎症を引き起こす可能性があるため、避けてください。
4. 最初に10%ポビドンヨードに浸したガーゼでマウスの背中を掃除し、次に70%エタノールを浸したガーゼで掃除します。手術領域の中心から外側に向かって、らせん状に領域を清掃します。手術前に手術部位が乾くまで約1分待ちます。
5. マウスの剃った背面を2本の指でゆるく持ち、準備した手術領域の中央で滅菌済みの6mmパンチ生検をしっかりと押します。皮膚をぴんと張らないでください。
   1. パンチ生検をひねって、輪郭の少なくとも1つのセクションで皮膚を完全に切り裂く円形の輪郭を皮膚に作成します。下にある筋膜や組織に切り込まないように注意してください。
   2. 滅菌ハサミと鉗子を使用して、パンチ生検によって刻印された円形パターンに従って表皮と真皮を切断します。

>4. 黄色ブドウ球菌 接種

1. 28 Gのインスリン注射器に、目的の生物発光細菌接種剤を充填します。この研究では、1 x 10⁸ CFU/mL(50 μL)の濃度を投与します。100μLを超える容量を投与しないでください。
2. マウスの背面の創傷の中央にある筋膜と組織の間に50μLの接種剤を注入します。接種剤が創傷の中心に気泡を形成し、漏れや分散が最小限に抑えられていることを確認します。
   1. 真皮を横に引き、シリンジを組織とほぼ平行に保持し、抵抗が急激に減少するまでシリンジを組織にゆっくりと押し込みます。これは筋膜のピアスを示しています。シリンジを傷口の中央に慎重に導き、接種剤をゆっくりと分注します。シリンジを動物からゆっくりと取り外します。
3. 上記のように、感染していない動物の創傷に同量の滅菌PBSを注入します。.
4. 動物をケージに戻します。ケージをヒートランプの下またはヒーティングパッドの上に置き、麻酔から回復するまで動物を監視します。

5. In Vivo BLIおよびFLI

1. 装置ソフトウェアを使用して、動物イメージャー全体を初期化します。2〜3 LPM酸素と2〜4%イソフルランを受容するチャンバー内でマウスを麻酔します。イメージャー内のノーズコーンに麻酔を送ります。
2. 負傷して感染したマウスをイメージャーに入れます。傷口ができるだけ平らになるようにマウスを配置します。次のシーケンス設定を使用して、マウスをイメージングします。
   1. イメージングモードとして「発光」と「写真」を選択します。露光時間はスモールビニングで1分、F/ストップ1(発光)、F/ストップ8(写真)です。発光フィルターは開いています。[取得] ボタンをクリックして、画像を記録します。
   2. イメージングモードとして[蛍光]と[写真]を選択します。露光時間はスモールビニングで1秒、励起波長465/30nm、発光波長520/20nmのF/ストップ1(蛍光)、F/ストップ8(写真)でランプ強度が高い。[取得] ボタンをクリックして、画像を記録します。
3. 動物をケージに戻し、麻酔から回復するまで監視します。
4. 上記のように毎日マウスをイメージします。

6. 画像解析

1. 数値化する画像を開きます。
2. 画像内の各マウスの周囲の皮膚を含む創傷領域全体に、大きな円形の関心領域(ROI)を配置します。好中球のin vivo FLI EGFPシグナルとin vivo BLI S. aureusシグナルは、数日後に創傷縁を超えて広がり、これらの研究に含まれていました(図2Aおよび2B)。[ROI の測定] をクリックし、各マウスの平均フラックスの値を記録します。各信号の平均磁束 (p/s) を時間に対してプロットします。
3. 創傷内の好中球または黄色ブドウ球の絶対数が必要な場合は、次の実験を行います。
   1. 好中球数をin vivo FLI EGFPシグナルと相関させるために、上記のようにC57BL/6Jマウスを創傷し、LysM-EGFPまたはLysM-EGFPxMyD88^-/-ドナーから骨髄由来の好中球の範囲(5 x 10⁵〜1 x 10⁷)を異なる創傷の上に直接移します。上述の画像で、in vivo FLI EGFPシグナルを既知の量の好中球と相関させます。
   2. 黄色ブドウ球菌CFUをin vivo BLIシグナルと相関させるため、上記のようにマウスを創傷および感染させる。感染後1日目に、マウスからのin vivo BLI信号を記録し、すぐに死体を安楽死させて冷やします。創傷を切除し、組織を均質化し、細菌希釈液を寒天上にプレートして一晩インキュベートします。翌日、コロニーを数え、創傷あたりのCFUを決定します。
4. 創傷治癒を測定するには、創傷エッジに円形のROIを当てはめ、創傷の面積(cm²)を測定し、ベースラインから時間に対する小数の変化をプロットします(図2C)。

結果

図1:ALC2906 3-4コロニー ALC2906 SH1000コロニーの_OD600とCFUカウントの相関関係を寒天プレートから選択し、10μg/mLのクロラムフェニコールを含むTSBに移して一晩培養しました。翌日、懸濁液を10μg/mLのクロラムフェニコールを含むTSBに1:50に分割し、培養しました。600 nm(OD₆₀₀)の光学密度を、分光光度計を使用して2時間後に一定間隔で測定しました。各測定で、細菌を氷冷PBSで1:100,000に希釈し、寒天プレートに分注して一晩インキュベートしました。翌日、CFUをカウントして初期濃度を計算し、OD₆₀₀と相関させました。N = 3で、実験ごとに4つの異なるOD₆₀₀測定値_{があります。}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
14 mL ポリプロピレン丸底チューブ	隼	352059
6mm使い捨て生検パンチ	インテグラミルテックス	33から36
生物発光黄色ブドウ球菌	ロイド・ミラー、ジョンズ・ホプキンス	ALC 2906 SH1000
ウシの血液寒天、5%、丈夫な診断	VWRの	10118-938
ブプレノプリン塩酸塩注射剤	西洋医療用品	7292	0.3 mg/mL
C57BL/6Jマウス	ジャクソン研究所	664
クロラムフェニコール(結晶性粉末)	フィッシャーバイオ試薬	BP904-100
DPBS(1倍)	ギブコ	14190-144
インスリン注射器	ベクトン・ディクソン・アンド・カンパニー	329461	.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'')
IVIS Spectrum In Vivoイメージングシステム	パーキン・エルマー	124262
リビングイメージソフトウェア IVIS Spectrumシリーズ	パーキン・エルマー	128113
LysM-eGFPマウス	トーマス・グラフ アルバート・アインシュタイン・カレッジ・オブ・ニューヨーク	NAの
微量分光光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ND-2000
MyD88 KOマウス	ジャクソン研究所	9088
不織布スポンジ	AMD-Ritmed株式会社	A2101-CH	5cm×5cm
ポビドンヨウ素10%溶液	アプリケア	697731
トリプシン大豆スープ	ベクトン・ディクソン・アンド・カンパニー	211825

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