マウスモデルにおける眼表面炎症の誘導法

要約

出典:Singh, J., et al.眼表面の炎症の誘発と関与組織の収集。J. Vis. Exp.(2022年度)

このビデオは、マウスモデルで眼表面の炎症とマイボーム腺の機能障害を誘発する方法を示しています。免疫原を用いてマウスの免疫系を刺激し、その後、同じ免疫原で再刺激すると、眼表面の炎症が促進され、好中球が産生するaggNETを介してマイボーム腺分泌が詰まり、ドライアイ疾患を引き起こします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウス眼表面炎症の誘発

1. 免疫のための免疫原調製を行います。
   1. 免疫日には、オボアルブミン(OVA、50 mg/mL)と百日咳毒素(100 μg/mL)を生理食塩水とアジュバント水酸化アルミニウム(40 mg/mL)(材料表参照)を1:1の割合で混合し、免疫原を新たに調製します。
      注意：層流安全キャビネットで百日咳毒素の開封、再構成、および免疫原調製を行います。防護服を着用し、皮膚に触れないようにしてください。
   2. 免疫原とアジュバントの混合物を室温で30分間インキュベートし、100 μLを1 mLシリンジにロードします。
   3. 麻酔されていないマウスで免疫原溶液の腹腔内注射を行います。
      1. ケージグリッドをつかみながら、マウスの尻尾をそっと持ちます。親指と人差し指で背中の皮膚と首の部分をしっかりと持ち、薬指と小指の間の尻尾と下肢を手のひらに固定します。
      2. 固定マウスの頭を下にしておいてください。
      3. 調製した免疫原溶液100μLを下腹部の右または左象限に注入します。
2. 免疫の2週間後に眼表面チャレンジを行います。
   1. マウスをイソフルラン(2.5%)で麻酔します。
   2. 片眼あたり5 μLのOVA(50 mg / mL)または生理食塩水(0.9 % NaCl)を両眼に塗布し、滴が眼に吸収されるまで待ちます。これには~5分かかります。
   3. この手順を毎日1回、7日間繰り返します.
      手記：薬の局所投与も同じ方法で行うことができます。

2. 眼の滲出液の収集

1. チャレンジ段階で形成された眼の滲出液を回収するには、チャレンジの直後に 50 μL の滅菌生理食塩水を眼に塗布します。

3. 眼表面組織の切除

1. 以下の手順に従って、まぶたと目の球体を解剖します。
   1. CO₂窒息と頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。
   2. マウスを平らな面に置きます。
   3. 70%エタノールを含浸させた綿棒で眼の周りの眼窩領域を消毒します。
   4. 耳と眼窩後洞の間、および扁平上皮骨の上の表面に沿って垂直に切開を行い、上顎骨に沿って下まぶたの下と前頭骨に沿って上まぶたの上に切開を水平に伸ばします。これにより、目の周りに切開が形成されます(図1)。
   5. 湾曲した鉗子を使用して、解剖した組織を目の周りで慎重に保持し、組織と眼球を引き出します。
   6. 切除した臓器を滅菌PBSに入れます。.
   7. 切除した上まぶたの周りの余分な顔の筋肉組織をメスと実体顕微鏡でトリミングします。
2. 以下の手順に従って結膜を採取します。
   1. 実体顕微鏡で乾いたシャーレに上まぶたを置きます。
   2. 細いピンセットとメスを使用して、まぶたの内面から白っぽい粘液層を非常に優しく剥がします。
3. 次に、以下の手順に従って角膜を解剖します。
   1. アイグローブをドライアイスの上の新しいドライシャーレに3分間置きます。
   2. ペトリ皿を安定した位置でベンチの表面に持っていきます。
   3. 細い鋭利なハサミを使用して、リンバスの隣の角膜の境界に小さな切開を行います。
   4. 眼球の周りのメスで切開を延長し、強膜を角膜から分離します。
   5. 角膜の裏側から虹彩と水晶体の残りを、生理食塩水でたっぷりと洗い流して取り除きます。

結果

図1:眼窩領域を取り巻く顔面組織の切除。切開痕は赤で示されます。これにより、眼の臓器を切除し、結膜や角膜などの付属眼器官に対するさまざまな局所投与治療の影響と効果を調査することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1x PBSの	ギブコ
水酸化アルミニウム	Imject alum アジュバント	77161	40 mg / mL < br /> 最終濃度:in vivo:1 mg / 100 μL
C57Bl/6マウス、7-9週齢	チャールズリバー研究所
湾曲した鉗子	FST by デュモン・スイス	5/45 11251-35
細く鋭いハサミ	FSTステンレス鋼、ドイツ	15001-08
層流安全キャビネット	ヘラセーフ
NaCl 0.9%(生理食塩水)	B.ブラウン
オボアルブミン(OVA)	エンドフィット、インビボゲン	〒9006-59-1	生理食塩水に10 mg/200 μL
百日咳毒素	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PHZ1174	50 μg/ 500 μL 生理食塩水 最終濃度:in vivo:100 μg/ 100 μL
ペトリディッシュ	グライナーバイオワン	628160
メス	羽根使い捨てメス	21位	最終濃度:in vivo:300 ng / 100 μL
実体顕微鏡	ザイス	ステミ508
シリンジ(角膜/虹彩洗浄)	BDマイクロレーン	27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm
シリンジ(i.p免疫)	BDマイクロレーン	24 G1インチ-Nr 17、055 * 25 mm