強力なTCRシグナルに対する胸腺細胞応答を調節するキナーゼ阻害剤の同定

要約

出典:Chen, E. W., et al.化学阻害剤ライブラリーのスクリーニングによるT細胞受容体シグナル伝達のメディエーターの同定。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、自己反応性CD4⁺CD8⁺ダブルポジティブ未成熟胸腺細胞のアポトーシスを調節する低分子キナーゼ阻害剤を同定する方法について説明しています。アポトーシスは、抗CD3および抗CD28コーティングされた磁気ビーズでそれらを活性化することにより、ダブルポジティブ胸腺細胞で誘導されます。その後、低分子阻害剤治療とフローサイトメトリー分析を行い、阻害剤がアポトーシスマーカーの発現を調節するかどうかを検出します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. Kinase Inhibitor Library Screening (Centrifuge-independent Assay)

1. キナーゼ阻害剤による胸腺細胞の治療
   1. 胸腺細胞懸濁液を調製します。
   2. 胸腺細胞を完全なRPMIで希釈して、25 x 10⁶細胞/mLの胸腺細胞懸濁液を得ます。
   3. マルチチャンネルピペットを使用して、小容量プレートの各ウェルに40 μLの胸腺細胞を添加します。プレートを氷の上に置きます。
   4. ストックプレート、DMSO、およびデキサメタゾンの阻害剤を、完全RPMIの4部と阻害剤/DMSO/デキサメタゾンの1部の比率で完全RPMIで希釈します(希釈係数5).
      手記：この小容量プレートでは、従来の方法に比べて使用する容量が5倍に少ないため、阻害剤とコントロール試薬を5倍に希釈してから、プレート内の胸腺細胞に添加します。
   5. ステップ1.1.4で調製したインヒビタープレートの対応するウェルから、0.5 μLのキナーゼ阻害剤を96ウェルプレートに加えます。
   6. 未処理のコントロールの8ウェルを準備します。ビヒクル処理コントロールのウェルを4ウェル調製し、ステップ1.1.4で調製したDMSOを0.5μL加えます。ステップ 1.1.4 で調製した希釈デキサメタゾンを使用して、5 μM デキサメタゾン処理コントロールの 4 ウェルを調製します(図 1)。

>2. 抗CD3/CD28ビーズを用いた胸腺細胞の刺激

1. ビーズが均一に再懸濁されていることを確認してください。ビーズ1mLを取り、PBS2mLで洗います。磁気スタンドを使用してビーズを分離し、溶液を吸引します。ビーズを1 mLの完全RPMI.
   に再懸濁します。 手記：ビーズとセルの比率は1対2.5です。ビーズの量は、刺激するウェルの数と使用する胸腺細胞の数に応じて調整します。
2. 各阻害剤処理サンプル、4つのDMSO処理サンプル、および8つの未処理サンプルのうち4つに10 μLのビーズ懸濁液を添加します。残りの4つの未処理ウェルに10 μLの完全RPMIを加えます。図1は、一般的なプレートのレイアウトを示しています.
   手記：ウェルの最終容量は50μLで、これはウェルの最大容量内です。クロスウェルのこぼれを避けるために、注意を払い、プレートを直立させることが重要です。
3. 混合するには、マイクロプレートオービタルシェーカーを使用してプレートを攪拌します。または、マルチチャンネルピペットを使用してウェルの内容
物を混合します。
4. 胸腺細胞を37°C、5%_CO2インキュベーターで17〜20時間(または一晩)インキュベートし、蒸発防止蓋を付けてインキュベートします。

3. プレートワッシャーのセットアップ

>注:プレートワッシャーのセットアップ手順は、製造元によって提供されています。手順については、以下で簡単に説明します。各プライミングステップには約150 mLの溶液が必要です。

1. 1% Tween 20 を含む 70% エタノールで洗浄システムをプライミングします。
2. 1% Tween 20 を含む脱イオン水で洗浄システムをプライミングします。
3. FACS洗浄バッファーで洗浄システムをプライミングします。

4. 表面抗原の染色

1. 抗TCRβ抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD69抗体を含む抗体染色混合物を調製します。抗体をFACS洗浄バッファーで1:100(v / v)の比率で希釈します。
2. プレートを9回洗浄し、1回の洗浄につき55μLのFACS洗浄バッファーを使用し、自動層流洗浄システムを使用します><。 手記：洗浄の終わりには、各ウェルに25μLの残留容量があります。
3. ステップ1.4.1で調製した染色用抗体混合物25 μLに細胞を再懸濁します。
4. サンプルを96ウェルプレートから移す場合は、抗体混合物50 μLに細胞を再懸濁し、サンプルを小容量プレートに移します。このステップは、図 2A に示されている方法番号 2 に対応します。
5. 混合するには、マイクロプレートオービタルシェーカーでプレートを攪拌するか、マルチチャンネルピペットを使用してサンプルを混合し、氷上で30分間インキュベートします。

5. 細胞の固定

1. プレートを9回洗浄し、1回の洗浄につき55μLのFACS洗浄バッファーを使用し、自動層流洗浄システムを使用します。
2. 固定/透過化バッファー(アクティブカスパーゼ-3アポトーシスキットに付属、ステップ1.6.1で説明した10x perm/washバッファーおよびステップ1.6.2の抗カスパーゼ-3抗体と同じ)をウェルあたり50 μLで追加します。
3. 氷上で30分間インキュベートします。

6. 活性型カスパーゼ3の細胞内染色

1. 25 mLの10x perm/wash bufferを225 mLの超純水で希釈して、1x perm/wash bufferを調製します。
2. 1 mLの抗カスパーゼ-3抗体を2 mLの1x perm/wash bufferに添加して、細胞内活性カスパーゼ染色液を調製します。抗体とパーマ/洗浄バッファーの比率は1:2です。
3. 1x perm/wash bufferで洗浄システムをプライミングします。
4. プレートを1x perm/wash bufferで9回、1回の洗浄で55 μLで洗浄します。
5. ステップ1.6.2で調製した細胞内カスパーゼ染色液25 μLをすべてのウェルに加えます。
6. 混合するには、マイクロプレートオービタルシェーカーでプレートを攪拌するか、マルチチャンネルピペットを使用してサンプルを混合し、氷上で1時間インキュベートします。
7. プレートを1x perm/wash bufferで9回、1回の洗浄で55 μLで洗浄します。
8. 25 μLのFACS洗浄バッファーをすべてのウェルに加えます。
9. ピペッティングで十分に混合した後、サンプルをマイクロタイターチューブに移します。
10. さらに50 μLのFACS洗浄バッファーを空のウェルに加え、ステップ1.6.9を繰り返します。
11. ステップ1.6.9と1.6.10を2回繰り返して、サンプルの200μLがマイクロタイターチューブに収集されます
    手記：ステップ1.6.10および1.6.11で説明されている手順の目的は、小容量プレートからの細胞の最大限の回収を確保することです。細胞数が問題にならない場合は、ステップ1.6.10の後、マイクロタイターチューブにFACS洗浄バッファーを200μLに補充するだけです。
12. サンプルのフローサイトメトリー解析を実行し、FACS解析プログラムで結果を解析します。カスパーゼ-3の活性化とCD69の発現は、CD4+CD8+DP胸腺細胞を含むゲートで解析されます。

結果

図1:胸腺細胞活性化アッセイのプレートレイアウト。(トップ)カラム1および12はコントロール用に予約されており、カラム2およびカラム11は阻害剤処理サンプル(ベージュ)です。ネガティブコントロール(非刺激[NS];灰色)はA1〜D1のウェルを占有し、細胞死のポジティブコントロール(デキサメタゾン処理[DEX];紫色)はE1〜H1のウェルを占有します。カラム2〜12には、抗CD3/CD28ビーズで刺激された胸腺細胞が含まれています。胸腺細胞活性化のポジティブコントロール(刺激されたサンプル[α-CD3/CD28];緑)はウェルA12〜D12を占め、ビヒクルコントロール(刺激されDMSO処理された[α-CD3/CD28 + DMSO];赤)はウェルE12〜H12を占めます。(ボトム)ダブルポジティブ(DP)ゲート内でゲートされた胸腺細胞の活性型カスパーゼ-3(ActCasp3)、CD69、およびTCRβ染色のフローサイトメトリープロット。さまざまなコントロールの代...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMI(ルプミ)	ハイクローン	SH30027FS
FBSの	ハイクローン	SH3007103
L-グルタミン	ハイクローン	SH3003401
ピルビン酸ナトリウム	ハイクローン	SH3023901
PBSの10倍	ビバンティス	PB0344 – 1L
キナーゼスクリーニングライブラリー (96ウェル)	ケイマンケミカル	10505	ライブラリの正確な内容は異なる場合があります
DMSOの	シグマ・アルドリッチ	D2650
デキサメタゾン	シグマ・アルドリッチ	D4902
抗CD3/CD28ビーズ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11452D
FITC アクティブカスパーゼ-3 アポトーシスキット	BDファーミンゲン	550480	固定/透過化バッファー、10X Perm/Washバッファー、抗カスパーゼ3抗体が含まれています
DAセルワッシャー	キュリオックス	HT1000
96ウェルDAセルプレート	キュリオックス	96-DC-CL-05
抗体
CD3e	バイオレジェンド	100236
TCRbの	BDバイオサイエンス	553174
CD4	BDバイオサイエンス	740007
CD8	BDバイオサイエンス	563786
CD69	eバイオサイエンス	〒25-0699-42
阻害 剤
TG003	ケイマンケミカル		Kinase Screening Libraryより
TG003	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
PKC 412	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ドラマピモッド	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
パクリタキセル	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
エルロチニブ	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ネクロスタチン-5	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
NVP-ベズ235	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
フタラジノンピラゾール	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AG-879	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
1-NA-PP1	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
トーリン1	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ビシンドリルマレイミドII	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ビブフ1120	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
SMI-4aの	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ビシンドリルマレイミドXI(塩酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10657	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AS-703026	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
塩化ケレリトリン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ツニカマイシン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
GSK 1059615	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ルキソリチニブ	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ネクロスタチン-1	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
SB 505124	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
INK128	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
カネルチニブ(塩酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
SB 431542	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
PD 173074	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
バルプロ酸(ナトリウム塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
PD 0325901	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
SBの203580	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
VX-702	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
エモディン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CHIR99021	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
バイオ	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
イマチニブ(メシル酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
スニチニブリンゴ酸	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ゲフィチニブ	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
PP2	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
3-メチルアデニン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ビシンドリルマレイミドI	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ビシンドリルマレイミドIV	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ビシンドリルマレイミドV	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
NSC 663284	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
D 4476	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
NU7026	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
H-9(塩酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
インジルビン-3'-モノキシム	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
KN-62	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
KN-93	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CGPの57380	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
イソオロモウシン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
(S)-グリシル-H-1152(塩酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ビシンドリルマレイミドVIII(アセテート)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ST638	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
SU 6656	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
LY364947	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
SB 203580 (塩酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10621	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
YM-201636	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ZM 447439	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AS-041164	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
NVP-AEW541(塩酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
PP242	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ABT-869	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10622	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
17β-ヒドロキシ麦汁マニン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10626	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
SU 6668	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10572	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
N,N-ジメチルスフィンゴシン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
LY294002	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
U-0126	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
スタウロスポリン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
KN-92(塩酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AS-605240(カリウム塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
O-1918	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
Y-27632 (塩酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
リーラミン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
PDの98059	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
PD 169316	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
TGX-221	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
(S)-H-1152(塩酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AS-605240	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
D-エリスロ-スフィンゴシンC-18	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
OSU03012	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
JNJ-10198409	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
リーラミン(塩酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
アラキドン酸リールアミド	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ラウリン酸リールアミド	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AS-252424	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10505	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
PI-103	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
PIK-75(塩酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
スフィンゴシンキナーゼ阻害剤2	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ピセアタンノール	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
SC-1	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
(R)-ロスコビチン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ベイ-43-9006	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10561	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AS-604850	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
PI3-キナーゼα阻害剤2	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ML-9	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
トリシリビン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
エルブスタチンアナログ	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ケンポーローネ	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
オロモウシン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AG-494	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AG-825	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AG-1478	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
SB 216763	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
SB 415286	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AG-17	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
H-8(塩酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
LFM-A13	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
SC-514	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
アピゲニン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AG-18	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10554	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
DRBの	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
RG-13022	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
RG-14620	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AG-490	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AG-82	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AG-99	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AG-213	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AG-183	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ラベンダスティンC	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ZM 336372	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
5-ヨードツベルシジン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
SB 202190 (英語	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10571	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ニロチニブ	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
SP 600125	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
L-スレオ-スフィンゴシンC-18	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
H-89	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
HA-1077(塩酸塩)	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AG-370	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ワートマニン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
AG-1296	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
KT5823	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ジャネックス1	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10574	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10575	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10576	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
NH125	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
TWS119	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
NSC 210902	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10577	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CAY10578	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
PD 184161	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
CCT018159	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより
ミリセチン	ケイマンケミカル	-	Kinase Screening Libraryより

の の の の の の ) の