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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 骨髄マクロファージの誘導と抗体による活性化
- CO2窒息を使用して安楽死を行います。
- マウスを誘導チャンバーに入れます。マウスを5%イソフルラン麻酔で60〜90秒間安楽死させますが、動かなくなり、呼吸が深く遅くなるまで
。
- イソフルラン麻酔をオフにし、マウスが呼吸を停止するまでCO2の6〜8 L / minを投与します。マウスをCO2をオンにした状態で、少なくともさらに5分間放置します。心拍や呼吸がなくなったことを確認します。死を確実にするために頸部脱臼を行います.
注:8〜12週齢のマウスは、マクロファージの収量が最も高くなります。
- マウスの脚に70%エタノールをスプレーし、フォームボードの上に仰臥位に伸ばした腕と脚で固定します。ハサミや鉗子で皮膚を押さえ、浅い切り込み(0.2cm)をして、後ろ足それぞれの表面から皮膚と毛皮を取り除きます
手記：この手順とすべての組織培養操作を滅菌フードで行ってください。
- 脛骨と大腿骨が見えるように筋肉をトリミングします。股関節のすぐ下と足首の上の骨と筋肉を切って、脛骨と大腿骨を取り除きます。できるだけ多くの筋肉をトリミングします。
- 骨に70%エタノールをスプレーし、蒸発するまで1分間待ってから、骨フラッシュ培地(Iscoveの改変ダルベッコ培地(IMDM)、10%ウシ胎児血清(FBS))の6ウェルプレートに入れます。
- 足首と大腿骨の上部から0.1cmの骨を切り取り、骨の空洞が露出するようにして、骨の端を切り取ります。骨髄が見え、26ゲージの針を骨腔に配置できることを確認します。
- 骨と筋肉を切って、脛骨と大腿骨を膝関節から分離します。10mLシリンジに取り付けられた26ゲージの針をキャビティに挿入します。骨髄を50mLのコニカルチューブに5mLの骨フラッシュ培地で洗い流します。1匹のマウスから2つの脛骨と2つの大腿骨を各50mLチューブに洗い流します。
- ピペットで数回上下させるか、骨髄を低速で渦巻き上げて、塊を穏やかに分散させます。骨髄のひもは、骨髄の小さな(0.5 mm未満)斑点に分割する必要があります。コニカルチューブに骨フラッシュ培地を50mLまで充填します。コニカルチューブの内容物を75 cm2組織培養処理フラスコにピペットで移し、37°C、5% CO2で1時間
インキュベートします
手記：成熟したマクロファージと間葉系細胞はフラスコに付着して廃棄されますが、目的の造血前駆細胞は懸濁液のままです。
- 造血前駆細胞を含む培地を50 mLの円錐チューブにピペットで移します。チューブを300 x gで室温で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを5 mLのマクロファージコロニー刺激因子(MCSF)培地(IMDM、10% FBS、5 ng/mL MCSF、100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、および150 μMモノチオグリセロール(MTG))に再懸濁します。
- 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。培地を0.5 x 106細胞/mL、1.5 x 107細胞/フラスコの濃度で細胞を30 mLの培地に添加し、ピペットで静かに上下させます。懸濁液30mLを新しい75 cm2組織培養処理フラスコにピペットで移します。
- ステップ 1.9 での初期培養後 4 日目と 7 日目に、逆位相コントラスト明視野顕微鏡を使用して、細胞が接着し、わずかに分岐していることを確認します。非接着性細胞を含む培地を廃棄します。細胞をIMDMで1回洗浄し、30 mLのMCSF培地を加えます。
- 細胞が10日目までに成熟したら(F4/80およびMac-1で>95%陽性)、細胞がわずかに接着していることを再度確認します。
- 刺激用の細胞をプレート化するには、フラスコから培地を取り出し、酵素を含まないEDTAベースの細胞解離バッファー8 mLを加えます(材料表)。細胞を37°C、5%CO2で5分間インキュベートします。
- 滅菌細胞スクレーパーを使用して、少量の圧力で細胞を穏やかに掻き取ります。顕微鏡で細胞がフラスコ表面から剥がれていることを確認します。解離した細胞を50mLのコニカルチューブにピペットで移します。フラスコを5mLのIMDMで3回すすぎ、採取した細胞とすすぎ液をプールします。細胞を300 x g、室温で5分間遠心分離します。
- 細胞ペレットを50 mLコニカルチューブあたり3 mLのMCSF培養培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して生細胞をカウントします。細胞を1 x 106細胞/mLの濃度で再懸濁し、96ウェル組織培養処理済み平底プレートのウェルあたり100 μLの細胞懸濁液(1 x 105細胞/ウェル)をプレート化します
手記： 1匹のマウスの骨は、100ウェルに十分な細胞を生成します。必要に応じて、1 mLの細胞を6ウェルプレート(組織培養処理済み、平底)に播種できます。より多くの細胞(1 x 106細胞)は、ウェスタンブロット分析に役立つ可能性があります。
- 付着したら、IMDM に 10 ng/mL の LPS、30 mg/mL の IVIg、または IVIg + LPS をそれぞれ添加したウェルを、重複ウェルまたは三重ウェルに刺激します。LPSまたはIVIgの用量を滴定して、応答を最適化することができます。重複または三重のウェルを刺激のないコントロールとして残します。それらを24時間(37°C、5%CO2).
でインキュベートします。
手記：再播種した細胞は、1時間以内に組織培養ウェルに接着する必要があります。
- 各ウェルから細胞上清を個々の1.7 mL微量遠心チューブに集め、10,000 x gで5分間遠心して粒子状物質を除去します。
- 細胞上清を取り除き、ペレットを乱さないようにします。清澄化された細胞上清を滅菌マイクロ遠心チューブに入れます.
手記： 細胞上清は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、サイトカイン(IL-10)およびサイトカインサブユニット(IL-12/23p40)のアッセイを直ちに行うか、または-80°Cで長期保存することができます。市販のキット(Table of Materials)のELISAプロトコールに従ってください。IL-6およびTNFのような他の炎症誘発性サイトカインは、LPS単独の刺激と比較してIVIg + LPS刺激との同時治療によっても減少するため、アッセイすることができる。刺激後、ウェスタンブロッティングや定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR)などの技術のために接着細胞を調製できます。