マウスモデルにおける抗体に応答した腹膜マクロファージのin vivo活性化

要約

出典:Kozicky, L., et al., 評価 マウスの骨髄および腹膜マクロファージの活性化に対する抗体ベースの薬物効果。J. Vis. Exp. (2017年度)

このビデオは、免疫グロブリンと細菌のリポ多糖類を静脈内投与してマウスの腹膜マクロファージを活性化する様子を実演しています。この共刺激により、腹膜マクロファージが活性化され、免疫調節活性を有する抗炎症性マクロファージが活性化されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 免疫グロブリンおよびリポ多糖(IVIg+LPS)の静脈内投与と腹膜マクロファージの採取による生体内マウスの挑戦

1. 各マウスの重量を量ります。2.5 g/kg 体重の最終用量を提供するために必要な IVIg の容量 (100 mg/mL ストック濃度) を計算します。0.2 μg/g 体重の最終用量を提供するために必要な LPS の量 (Iscoveの改変ダルベッコ培地 (IMDM) の 100 μg/mL ストック濃度) を計算します。
   手記：例えば、20 gマウスの場合、500 μLのIVIgストック溶液と40 μLの100 μg/mL溶液LPSが必要です。
2. 必要な量のIVIgとLPSを、滅菌済みの26ゲージ針を取り付けた滅菌済みの1mLシリンジに引き込みます。IVIgを投与されない対照マウスの場合は、同量のIVIgを滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH 7.4に交換します。
3. 片手でマウスの首の後ろの皮膚を親指と人差し指でつかみ、残りの指で尻尾と後ろ足をつかみます。体を地面に向けて傾
けます。
4. マウスの腹部に対して30〜40°の角度で針を右下の象限に置き、面取りして1.5cm挿入します。 IVIg + LPSまたはPBS + LPSを腹腔内に注入します。
5. 1時間後、二酸化炭素(CO₂)窒息を使用して安楽死を行います。
   1. マウスを誘導チャンバーに入れます。マウスを5%イソフルラン麻酔で60〜90秒間安楽死させますが、動かなくなり、呼吸が深く遅くなるまで
   。
   2. イソフルラン麻酔をオフにし、マウスが呼吸を停止するまでCO₂の6〜8 L / minを投与します。マウスをCO₂をオンにした状態で、少なくともさらに5分間放置します。心拍や呼吸がなくなったことを確認します。死を確実にするために頸椎脱臼を行います。
      注:8〜12週齢のマウスは、マクロファージの収量が最も高くなります。
6. マウスを発泡スチロールボードに固定し、手足を広げます。70%エタノールを部品にスプレーします.
   手記：滅菌フードで手順を実行します。
7. 腹腔を切らないように、マウスの正中線に沿ってハサミで皮膚(0.2 cm)を浅く切り込みます。鉗子を使用して腹部の皮膚をマウスの腹から引き抜き、無傷の腹壁の内壁が見えるようにします。
8. 5 mLシリンジに5 mLの滅菌PBS(pH 7.4)を入れます。25ゲージまたは27ゲージの針をキャビティの上部に、針の斜角を上にして、左側または右側からマウスの中心に向かって挿入します。
   手記：PBSを臓器に注入するのではなく、腹膜腔に注入しないように、針をマウスに慎重に配置します。
9. 液体を腹腔に押し込みます。針を空洞から引き出し、腹膜を10秒間マッサージして細胞を取り除きます。針を空洞の上部に挿入し、臓器を避けます。15mLの円錐形チューブに回収した洗浄液を集めて氷上に置きます.
   手記：5 mLの液体を注入するごとに、約3.75 mLが回収されます。
10. 注射と回復(ステップ1.8〜1.9)をさらに3回(総注入量20 mL)繰り返して、合計15 mLの洗浄液を回収します。.各マウスからの洗浄液を別々の15 mLコニカルチューブに集めます。
    手記：最終注入後は、マウスの左端と右端に液が溜まったところから液を取り出す方が楽な場合があります。臓器は、この位置で針との干渉をあまり引き起こしません。
11. 細胞を300 x gで5分間、4°Cでスピンダウンし、回収した洗浄液1 mLを取り出し、メーカーの指示に従って酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によるインターロイキンまたはIL-10およびIL-12/23p40分析に使用するか、将来の分析のために-80°Cで凍結します
    手記：洗浄液サイトカイン分析の処理間の正確な比較を確実に行うには、腹腔の5 mLフラッシュを4回行い、最終容量を15 mLにします。各フラッシュからすべての液体が回収されるわけではありません。
12. マウス1匹につき500 μLのプレーティング培地(IMDM、10%ウシ胎児血清、FBS、および100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン)に細胞を再懸濁します。生存可能なマクロファージをカウントします。
    手記：マクロファージは、他の腹膜細胞よりもわずかに大きくなります。典型的な収量は、野生型C57BL/6マウスを使用した5 x 10^5-1 x 10⁶マクロファージ/マウスです
    随意：細胞ペレット中に多数の赤血球が存在する場合は、製造元の指示に従って溶解ステップを実行し、赤血球を除去します。
13. 細胞を1 x 10⁶マクロファージ/mLのプレーティング培地に再懸濁し、96ウェル平底組織培養プレートでウェルあたり100 μLのプレートにしてください。
    手記：実験のために複数のマウスの細胞をプールする必要がある場合があります。例えば、1匹のマウスが5×10⁵個のマクロファージを持っていた場合、500μLのプレーティング培地が必要になります。
14. 細胞を37°C、5%CO₂で1時間インキュベートし、マクロファージが接着することを確認します。接着細胞は腹膜マクロファージです。細胞上清および非接着性細胞を除去します。ウェルを200 μL IMDM(37°Cに予熱)で2回すすぎ、10秒間待ってから、プレートをゆっくりと傾けます。めっき媒体を交換してください。刺激する前に、細胞を37°C、5%CO₂で30分間インキュベー
トします。
15. 付着したら、IMDM に 10 ng/mL の LPS、30 mg/mL の IVIg、または IVIg+LPS をそれぞれ添加したウェルを、重複ウェルまたは三重ウェルで刺激します。LPSまたはIVIgの用量を滴定して、応答を最適化することができます。重複または三重のウェルを刺激のないコントロールとして残します。それらを24時間(37°C、5%CO₂).
    でインキュベートします。 手記：再播種した細胞は、1時間以内に組織培養ウェルに接着する必要があります。サンプルは、すぐに使用することも、ELISAによるサイトカイン分析のために-80°Cで凍結して保存することもできます。
16. 各ウェルから細胞上清を個々の1.7 mL微量遠心チューブに集め、10,000 x gで5分間遠心して粒子状物質を除去します。
17. 細胞上清を取り除き、ペレットを乱さないようにします。清澄化された細胞上清を滅菌マイクロ遠心チューブに入れます.
    手記：細胞上清は、サイトカイン(IL-10)およびサイトカインサブユニット(IL-12/23p40)について、ELISAで直ちにアッセイするか、または-80°Cで長期保存することができます。市販のキット(材料表)のELISAプロトコルに従ってください。IL-6や腫瘍壊死因子(TNF)などの他の炎症誘発性サイトカインも、LPS単独の刺激と比較してIVIg + LPS刺激との同時治療によって減少するため、アッセイできます。刺激後、ウェスタンブロッティングや定量的ポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR)などの技術のために接着細胞を調製できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
イスコーブの修正ダルベッコ培地(IMDM)	ライフテクノロジー	12440053
ウシ胎児血清(FBS)	ライフテクノロジー	〒12483-020
ペニシリン-ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15140148
1X赤血球溶解バッファー	eバイオサイエンス
細胞解離バッファー	ライフテクノロジー	13150016	酵素フリー、ハンクスベース、EDTA
リポ多糖類(LPS)	シグマ・アルドリッチ	L 4516	大腸菌0127:B8から
IVIg(ガムネックス)	グリフォルス	BC小児病院輸血医学より提供
IVIg(ガンマガルド液)	バクスターヘルスケアコーポレーション	BC小児病院輸血医学より提供
IVIg(オクタガム)	オクタファルマ	BC小児病院輸血医学より提供
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(滅菌)、pH 7.4	ライフテクノロジー	10010023
マウスIL-10 ELISA	BDバイオサイエンス	555252
マウス IL-12/23p40 ELISA	BDバイオサイエンス	555165
26gの針	BDバイオサイエンス	305110
1 mLシリンジ	BDバイオサイエンス	309659
10 mLシリンジ	BDバイオサイエンス	309604
15 mLコニカルチューブ	BDバイオサイエンス	352096
鉗子	VWRの	82027-386	細い先端、解剖
鋏	VWRの	82027-582	デリケート、4 1/2インチ
明視野顕微鏡	動機	AE31	反転位相コントラスト
規模	メトラー	PE 3000