マウスモデルにおける細菌感染に対するワクチン誘導性免疫の評価

要約

出典:Caution, K., et al.マウスにおける宿主病原体応答とワクチンの有効性の評価。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、マウスの百日咳菌感染に対する無細胞性百日咳ワクチンの有効性をテストするためのプロトコルについて説明します。ワクチン接種後、マウスを感染させ、その組織ホモジネートを培養して、ワクチン誘発性防御免疫の読み出しとして細菌コロニーを分析しました。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マウスの予防接種

1. 生理食塩水やDPSなどの滅菌生理学的緩衝液でマスターワクチンミックスを調製します
   手記：混合物の総量は、グループ全体の免疫化に必要な量よりも10%多く含む必要があります。.ワクチン組成物の濃度は、以下のステップ1.1.1および1.1.2で詳述されています。アイテムを氷上のビバリウムに運びます。
   1. 百日咳菌の研究では、次のワクチン群を含めます:無細胞百日咳ワクチン(aPV)およびaPV +ボルデテラコロニー形成因子A(BcfA)。また、ミョウバン、ワクチン抗原単独(糸状赤血球凝集素(FHA)、ペルタクチン(Prn))、ナイーブ(非免疫)マウスを対照群として用いる
      注:aPVは、破傷風トキソイド、減少ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド(PT)、糸状赤血球凝集素(FHA)、およびアルミニウム塩に吸着したペルタクチン(Prn)で構成されるFDA承認のaPVのヒト用量の1/5です。現在の百日咳aPVの1人のヒト用量は0.5mLであるため、用量の1/5^は0.1mLです。aPV + BcfAの容量は、マウスあたり0.1 mLのaPV(ヒト^用量の1/5)+ 0.046 mLのBcfA(30 μg)です。1つの筋肉に安全に送達できる最大容量は0.1mLです。aPV+BcfAワクチンの量は0.1mLより大きいため、安全に投与するためには、ワクチンを両肩にほぼ均等に分けて送達する必要があります。
   2. 実験用ワクチンを調製するには、1回の投与で、1μgのFHAと0.5μgのPrnを、滅菌PBS中の50μgの水酸化アルミニウムゲルと組み合わせます。実験用aPVを実験室用ローラーで室温(RT)で15分間混合します。その後、チューブを18,000 x gで4°Cで5分間遠心し、上清を取り除き、内容物を滅菌PBS1 mLに再懸濁します。
2. ビバリウムで、麻酔器をセットアップします(図1).
   手記：使用する前に、それぞれのタンクに適切なレベルの酸素とイソフルランがあることを確認してください。イソフルランスカベンジャーキャニスターの重量を量り、重量が50 g増加したら交換します。
3. 生物学的安全キャビネット(BSC)を徹底的に清掃し、清潔な誘導チャンバーをBSC内に配置します。麻酔器からの麻酔ラインとスカベンジャーラインを誘導室に接続します。レギュレーターを介して酸素タンクを開き、酸素が流れていることを確認し、レベルを1.5〜2 L / minに設定します。
4. 希望の年齢(6〜12週)のマウスを誘導チャンバーに入れます。マウスに軽く麻酔をかけるために、イソフルランを2.5〜3%にオンにします。動物がチャンバー内で動かなくなり、呼吸が遅くなるまで、動物を監視します。
5. つま先をつまんで誘導のレベルをテストし、反射的な動きを観察します。何もない場合、マウスは注入する準備ができています。
   注:この実験では、動物のケージ全体を一度に麻酔しました。動物を個別に麻酔して注射するか、麻酔なしで動物に注射するかを選択できます。これらの方法のいずれかが適切です。
6. その間、1 mLのインスリン注射器(28G1/2)にそれぞれ0.1 mLのワクチンを準備します。動物が完全に誘導されたら、1匹の動物をチャンバーから取り出し、マウスを腹側にタオルまたはベンチパッドの上に置きます。
7. ワクチンを筋肉内投与します。シリンジを45°の角度にし、ベベルを上に向けて、シリンジをマウスの三角筋に~5mm挿入し、ワクチンを注射します
   手記： 後肢/脇腹は、三角筋の代わりに注射部位として使用できます。
8. 注射後、針を筋肉に挿入したまま 5 ~ 10 秒間保持します。容量が供給されたら、シリンジを180°回転させて、ベベルが反対側を向くようにしてシールを作成し、ワクチンの漏れを防ぎます。次に、注射部位から針をゆっくりと引き出します。
9. マウスをケージに戻します。指定されたグループ内のすべての動物に対して手順を繰り返します。
10. イソフルランの電源を切り、誘導チャンバーを酸素で洗い流してから、マウスの次のケージに麻酔をかけます。
11. 動物全員が警戒してケージの中で動くまで、動物を監視します。ケージをハウジングの場所に戻します。
12. ワクチン接種後12時間ごとに、最大48時間まで動物を監視し、荒れた/ボサボサのコート、遅い歩行、苦しい呼吸などの罹患率の臨床症状がないか調べます。症状が続く場合は、施設の獣医師に相談し、必要に応じてマウスを研究から除外してください。.
13. 初回免疫の4週間後、麻酔をかけ、以前に投与されたのと同じワクチン製剤でマウスの右三角筋に筋肉内注射を投与することにより、マウスをブーストします。
14. 繰り返しになりますが、臨床症状がないか動物を監視します。さらに2週間動物を飼い、その後感染を進行させます。

2. マウス鼻腔内感染モデル

1. ビバリウムで、ステップ1.3および1.4で説明されているように、酸素と麻酔の条件を設定します。ステップ1.5で説明したように、マウスをチャンバーに入れて麻酔します。麻酔が効くまで動物を監視します。
2. マウスに麻酔をかけたら、一度に1匹ずつ誘導チャンバーから取り出します。背側胸部の首筋、肩甲骨と首の後ろでマウスを拾います。マウスを直立させて鼻にアクセスします。
3. 200 μLのピペットチップを使用して、40〜50 μLの百日咳菌の接種液をマウスの鼻にゆっくりと塗布します(各ネアに20〜25 μL)。接種物全体が動物に吸い込まれるまでマウスを保持します。接種物の一部が泡立った場合は、気泡を集めて鼻腔に再注入します。ネガティブコントロールとして、同量の滅菌PBSをマウスの1つのグループに送達します。
4. 手順1.10-1.12で行ったように、接種した動物をケージに戻し、動物が警戒して動くまで監視します。ケージをラック上の元のハウジングスペースに戻します。誘導チャンバーを酸素で洗い流して残留イソフルランを除去してから、次の動物セットを麻酔します。感染後48時間動物を監視します。
5. 実験室では、無菌PBSで接種物の段階希釈をプレート化して、マウスに送達された実際のコロニー形成単位(CFU)を確認します。10% BG + Smプレート(10%除細動羊の血液と100 μg/mLストレプトマイシンを添加したBordet-Gengou寒天プレート)に0.1 mLの希釈液をプレートします(図2A)。プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、4日間成長させます。マウスに送達した接種物からCFUをカウントし、計算します(図2B)。

3. 感染後の動物組織の採取

1. マウスの解剖と組織採取の準備をします。
   1. オートクレーブで組織を処理するために必要なすべてのツール(粗いハサミと細かいハサミ、湾曲したハサミ、細かい鉗子、ペレット乳棒、三角形のスプレッダー)を滅菌します。滅菌ポーチにツールを密封します。ガラスを箔で覆い、ホモジナイザーをホイルで包み、無菌性を示すためにオートクレーブテープを追加します。
   2. 組織採取の1日または2日前に寒天プレートを準備し、プレートが固化してから使用してください。百日咳菌については、10% BG + Sm.を各マウスの肺にラベルプレートを使用し、各実験で経験的に決定された所望の希釈液を
   投与します。
   3. CFU希釈チューブを充填し、標識します。滅菌済みPBS0.9 mLを滅菌済み1.5 mL微量遠心チューブに加え、処理する臓器の数と臓器あたりの希釈量に基づいてください。
   4. 組織採取用のチューブの充填とラベル付け:
      1. 肺:PBS中の滅菌1%カゼイン2 mLを滅菌した15 mLコニカルチューブに加え、4°Cで保存します。組織学のために肺を採取するには、10%中性緩衝ホルマリン(NBF)を2 mL追加し、RTで保存します。
   5. 新鮮な70%エタノールは、ビーカーを充填し、解剖用のボトルをスプレーするために準備する必要があります。
2. 収穫日には、すべての材料をカートでビバリウムに運びます。BSCを清掃し、手順1.3および1.4のように麻酔器をセットアップします。
3. 解剖するマウスを誘導室に入れ、酸素が流れる状態でイソフルランを5%にオンにし、動物が意識を失うまで待ちます。マウスを一度に1匹ずつ取り除き、死を確実にするための二次的な方法として動物を子宮頸部脱臼させます。頸部脱臼の後、安楽死は、呼吸数の欠如および/または離脱反射の欠如によって確認されるべきです(つま先ピンチテスト)。
4. マウスの腹側を上に向けて解剖ボードに置き、腕と脚をピンで固定して開きます。マウスの体に70%エタノールをスプレーします。
5. 鉗子を使用して、骨盤の中央にある腹部の下の皮膚を握りしめます。鋭利なハサミを使用して、下顎骨まで垂直に切り込みを入れます。次に、ハサミを閉じた状態で小さな動きを使用して、2つの層を押し広げて皮膚を腹壁から離剖します。死体の側面に皮膚を置き、無菌臓器摘出のための遮るもののないフィールドを作成します。
6. 鉗子を使用して剣状突起で胸郭を安定させ、横隔膜を切り開きます。肺は収縮し、背骨に向かって落ちるはずです。側面の胸郭を切り開いて、胸当てを取り外します。
7. 右肺の上葉を分離して切除し、肺動脈と静脈を切断します。ローブを10%NBFを含む15mLの円錐形チューブに入れ、チューブをRTに少なくとも24時間置いて組織を固定します。.右肺と左肺の残りの葉を分離します。PBSに2mLの1%カゼインが入った15mLのコニカルチューブにローブを入れ、氷の上に置きます。
8. 死骸はバイオハザードバッグに捨てます。次の動物を解剖する前に、脱イオン水でツールをすすぎ、次に70%エタノールで満たされたビーカーに入れます。ツールを取り外し、余分なエタノールを振り落としてから、次の解剖に進みます。
9. 上記の手順に従って、各マウスを解剖します。
10. 以下に説明するように組織を処理します。

4. 肺の処理

1. 肺(PBS中の1%カゼイン2mL)を滅菌済みの15mLデュースホモジナイザーに移します。.乳棒を使用して組織を均質化します。組織の大きな粒子がなくなるまで解離します。均質化された懸濁液を元の15 mLチューブに戻します。
2. CFUをプレーティングするための0.3 mLアリコートを取り出し、ホモジネートを450 x gで4°Cで5分間遠心分離します。0.5 mLアリコート中の上清を事前に標識したマイクロ遠心チューブに回収して分注します。ELISAによるサイトカインの分析まで、サンプルを-20°Cで保存します。
3. 希釈チューブ内の均質化された肺懸濁液0.1 mL(滅菌PBS0.9 mL)を段階希釈することにより、選択した希釈液を調製します。経験的に選択した希釈液0.1 mLを、あらかじめ標識した10% BG + Smプレートにプレートし、滅菌済みのトライアングルスプレッダーを使用して広げます。
4. プレートを室内空気中で37°Cで4日間インキュベートします。
5. CFU/肺のカウントと計算(図3)。簡単に言うと、回収されたCFUの数にプレートの希釈係数を掛け、次に臓器が処理された総量を掛けます。その後、CFU の計算は各動物の Log₁₀ 値に変換され、グラフ化されます。
   1. 30〜300コロニーのプレートは、簡単かつ正確にカウントされます。コロニーが6未満のプレートは、コロニー数が少ないとエラーが発生するため、計算に使用しないでください。検出の下限を得るために、臓器がホモジナイズされた総容量を、希釈されていないホモジネートからプレート上にスポットするために使用された容量で除算します(たとえば、2 mLの総容量を0.1 mLの希釈されていないホモジネートで割ると、検出可能な20 CFUの下限に等しくなります)。

結果

図1:麻酔器のセットアップ。示されているのは、誘導チャンバーとスカベンジャーシステムが取り付けられた麻酔気化器です(生物学的安全キャビネット内)。

図2:送達された鼻腔内接種物の計算。(A)^10-4、^10-5、および^10-6に希釈された感染接種の段階希釈の概略図。これらの希釈液を10% BG + Smに播種し、37°Cで4日間インキュベートした後、計数します。(B)次に、^10-4、^10-5、および^10-6

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2L誘導チャンバー	獣医装備	941444
フルリソ	ベットワン	V1 501017	どんなブランドでも適切です
カゼイン	シグマ	C-7078
ボルデ ゲンゴウ 寒天培地	BDバイオサイエンス	248200
器具 - はさみ、カーブはさみ、鉗子、細い鉗子、三角形のスプレッダー			どんなブランドでも適切です
15mLダウンスティッシュグラインダー	ウィートン	357544	類似のブランドが適切です
コードレスハンドホモジナイザー	コンテス/シグマ	Z359971-1EA	類似のブランドが適切です
3mLシリンジ	BDバイオサイエンス	309657
15mLコニカルチューブ	漁夫	339651
1.5mLマイクロチューブ	デンビル	C2170
1mLインスリン注射器 28G1/2	フィッシャーサイエンティフィック/エクセルインターナショナル	14-841-31