抗原被覆ビーズによる活性化後のBリンパ球におけるオルガネラダイナミクス

要約

出典: Ibañez-Vega, J., et al., Studying Organelle Dynamics in B cells During Immune Synapse Formation. J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、抗原コーティングされたマイクロビーズでBリンパ球の活性化後の細胞小器官の動態を研究する方法について説明します。

プロトコル

>注:次の手順は、IIA1.6 Bセルを使用して実行されました。

1. 抗原被覆ビーズによるB細胞の活性化

1. 抗原コーティングビーズの調製
   1. B細胞を活性化するには、50 μL (~20 x 10⁶ビーズ) の3 μm NH₂-ビーズを活性化(BCR-ligand+)または非活性化(BCR-ligand-)抗原とともに調製した、抗原で共有結合的にコーティングされたNH₂-ビーズ(Ag-coated beads)を使用します。
   2. IIA1.6 B細胞の場合、BCR-リガンド+として抗IgG-F(ab')₂フラグメントを使用し、BCR-リガンド-として抗IgM-F(ab')₂またはウシ血清アルブミン(BSA)を使用します。初代B細胞またはIgM+ B細胞株を活性化するには、BCRリガンド+として抗IgM-F(ab')₂を、BCR-リガンド-.
      としてBSAを使用します。 手記： リガンドのFc受容体への結合を避けるためには、完全長抗体の代わりにF(ab')またはF(ab')₂抗体フラグメントを使用してください。
   3. Agコーティングビーズの調製を進めるには、ビーズを低タンパク質結合性微量遠心チューブに入れて、サンプル操作中のビーズの回収率を最大化します。1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1 mLを添加してビーズを洗浄し、16,000 x gで5分間遠心分離します。上清を吸引します。
   4. ビーズを500μLの8%グルタルアルデヒドで再懸濁してNH₂基を活性化し、室温(RT)で4時間回転させます
      注意： グルタルアルデヒド原液は、化学フュームフードでのみ使用してください。製品安全データシート(MSDS)の指示に従ってください。
   5. ビーズを16,000 x gで5分間遠心分離し、グルタルアルデヒドを除去し、1 mLの1x PBS.
      でさらに3回洗浄します。 注意： グルタルアルデヒド溶液は、有害な化学廃棄物として廃棄する必要があります。
   6. 活性化ビーズを1x PBSの100 μLに再懸濁します。サンプルは、BCR-ligand+に50 μL、BCR-ligand-に50 μLの2つの低タンパク質結合性微量遠心チューブに分けることができます。
   7. 抗原溶液を調製するには、150 μLのPBS中に100 μg/mLの抗原溶液を含む2 mLの低タンパク質結合微量遠心チューブを2本使用します:1本はBCR-リガンド+、もう1本はBCR-リガンド-です。
   8. 150 μLの抗原溶液が入った各チューブに50 μLの活性ビーズ溶液を加え、ボルテックスし、4°Cで一晩回転させます。
   9. 10 mg/mL BSAを500 μL加えてビーズ上の残りの反応性NH₂基をブロックし、4°Cで1時間回転させます。
   10. ビーズを16,000 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。ビーズを冷たい1x PBSでさらに3回洗います。
   11. 活性化ビーズを70 μLの1x PBSに再懸濁します。
   12. Agコーティングビーズの最終濃度を決定するには、少量のビーズをPBS(1:200)で希釈し、血球計算盤を使用してカウントします。その後、使用するまで4°Cで保存します.
       手記：Agコーティングビーズは1ヶ月以上保存しないでください。

>2. ポリ-L-リジンカバースリップの作製

1. Agコーティングビーズを用いたB細胞活性化アッセイの前に、ポリ-L-リジンコーティングされたカバースリップ(PLLカバースリップ)を調製します。40 mLの0.01% w/vのPLL溶液を含む50 mLチューブを使用し、直径12 mmのカバースリップを溶液に浸します。RTで一晩中ローテーションします。
2. カバースリップを1x PBSで洗い、パラフィンフィルムで覆われた24ウェルプレートの蓋で乾燥させます。B細胞の活性化を進めます。

>3. B細胞の活性化

1. ビーズでB細胞の活性化を開始するには、まずIIA1.6 B細胞株をCLICK培地(RPMI-1640に2 mM L-アラニン-L-グルタミン + 55 μM β-メルカプトエタノール + 1 mM ピルビン酸 + 100 U/mLペニシリン + 100 μg/mLストレプトマイシン)+ 5%熱不活化ウシ胎児血清[FBS])で1.5 x 10⁶細胞/mLに希釈します。
2. 100 μL (150,000 cells) の IIA1.6 B 細胞と Agコーティングビーズを 0.6 mL チューブ内で 1:1 の比率で組み合わせます。ボルテックスを使用して穏やかに混合し、PLLカバースリップに種をまきます。細胞培養インキュベーター(37°C/5%CO₂)でさまざまな時点をインキュベートします。一般的なアクティブ化タイム ポイントは、0、30、60、および 120 分です。時間0の場合は、PLLカバースリップを氷上の24ウェルプレート蓋に入れます。細胞-Agコーティングビーズ混合物を添加し、氷上で5分間インキュベートします.
   手記： ピペッティングで上下に行うのではなく、ボルテックスで混合することが重要です。これは、ピペットのプラスチックチップにビーズが蓄積するため、サンプル中のビーズの数が減少する可能性があるためです。BCR-リガンド-でコーティングされたビーズを各アッセイのネガティブコントロールとして使用します。最初に最も長いインキュベーション時間を有効にし、次に次の時点を有効にすることをお勧めします。サンプルの活性化間隔を計算して、同時に固定の準備が整
うようにします。
3. 各カバースリップに100 μLの冷たくした1x PBSを加えて活性化を停止し、免疫蛍光プロトコールを続行します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
IIA1.6(A20変異体)マウスBリンパ腫細胞	ATCCの	TIB-208	FcγIIRを伴わずに表面にIgG含有BCRを発現するBalb/c起源のマウスB細胞リンパ腫
メタノール100%	フィッシャーサイエンティフィック	A412-4
直径10mmカバーガラス厚さNo.1円形	マリエンフィールド-スーペリア	111500
アミノダイナビーズ	サーモフィッシャー	14307D
反ペリセントリン	アブカム	AB4448 (英語	1:200の希釈を推奨しますが、最適化する必要があります
アンチrab6	アブカム	ab95954	1:200の希釈を推奨しますが、最適化する必要があります
アンチsec61	アブカム	ab15575	1:200の希釈を推奨しますが、最適化する必要があります
BSAの	ウィンクラー	BM-0150
ポリビーズアミノミクロスフェア 3.00μm	ポリサイエンス	17145-5
ポリ-L-リジン	シグマ	P8920	滅菌水で希釈します
RPMI-1640	バイオ産業	01-104-1A
トリトンX-100	メルク	〒9036*19-5
チューブ50 ml	コーニング	353043

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