抗原被覆カバーガラス上のB細胞活性化

要約

出典: Ibañez-Vega, J., et al., Studying Organelle Dynamics in B cells During Immune Synapse Formation. J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、in vitroでのB細胞の活性化を示しています。このプロセスには、B細胞受容体との抗原相互作用が関与し、細胞骨格のリモデリング、免疫シナプス形成、リソソームの移動、抗原の内在化、プロセシング、およびその後のB細胞活性化のためのMHC分子への提示につながります。

プロトコル

1. ポリ-L-リジンカバースリップの作製

1. Agコーティングビーズを用いたB細胞活性化アッセイの前に、ポリ-L-リジンコーティングされたカバースリップ(PLLカバースリップ)を調製します。40 mLの0.01% w/vのPLL溶液を含む50 mLチューブを使用し、直径12 mmのカバースリップを溶液に浸します。RTで一晩中ローテーションします。
2. カバースリップを1xPBSで洗い、パラフィンフィルムで覆われた24ウェルプレートの蓋で乾かします。B細胞の活性化を進めます。

2. 抗原被覆ガラス上のB細胞活性化

1. 抗原被覆カバースリップの調製
   1. 活性化する前に、抗原溶液(10 μg/mL BCR-ligand+および0.5 μg/mLラット抗マウスCD45R/B220を含む1x PBS)を調製します。
   2. 注:アッセイの前日にカバースリップを準備することを検討してください。B220はB細胞の接着を改善しますが、BCR-Ligand+は拡散応答を生成するのに十分です。
   3. 12 mmのカバーガラスをパラフィンフィルムで覆われた24ウェルプレートの蓋に置き、各カバーガラスに40 μLの抗原溶液を加え、4°Cで一晩インキュベートします。抗原溶液の蒸発を避けるためにプレートを密封します。
   4. カバースリップを1x PBSで洗い、風乾します。
2. B細胞の活性化
   1. 活性化を開始するには、IIA1.6 B細胞をCLICK培地+ 5% FBSで1.5 x 10⁶細胞/mLに希釈します。
   2. 抗原コーティングされたカバースリップ(Agカバースリップ)に100μLの細胞を加え、細胞インキュベーター内で37°C/5%CO₂でさまざまな時間活性化します。一般的なアクティブ化タイム ポイントは 0、30、および 60 分です
      手記：セクション1と同様に、すべてのサンプルを同時に固定するために、最も長いアクティブ化ポイントから開始することをお勧めします。
   3. 時間0の場合、Agカバースリップが入った24ウェルプレートの蓋を氷上に置き、セルを追加します。氷上で5分間インキュベートします。
   4. 各Agカバースリップ上のメディアを慎重に吸引し、100 μLの冷たい1x PBSを加えて活性化を停止します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
IIA1.6(A20変異体)マウスBリンパ腫細胞	ATCCの	TIB-208	FcγIIRを伴わずに表面にIgG含有BCRを発現するBalb/c起源のマウスB細胞リンパ腫
CaCl2	ウィンクラー	CA-0520
グリシン	ウィンクラー	BM-0820
HyClone ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	03 SH30071月	56°Cで30分間不活化
KClの	ウィンクラー	PO-1260
NaCl	ウィンクラー	SO-1455
パラフィルム	メートル	P1150-2
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122	液体
ポリ-L-リジン	シグマ	P8920	滅菌水で希釈します
RPMI-1640	バイオ産業	01-104-1A
ピルビン酸ナトリウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11360070
チューブ50 ml	コーニング	353043
2-メルカプトエタノール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21985023
グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050061
ヤギ抗マウスIgG抗体	ジャクソン免疫研究	〒315-005-003	IIA1.6 ポジティブリガンド

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