In vitroでのマウス骨髄細胞の破骨細胞形成に対する抗C-fms抗体の効果

要約

出典:Marahleh, A., et al. 抗c-fms抗体がin vitroでの破骨細胞の形成と増殖に及ぼす影響。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオでは、破骨細胞の祖先から破骨細胞が形成されるプロセスである破骨細胞形成に対する、異なる抗c-fms抗体濃度の影響を示しています。

プロトコル

>1. BMMの生成

1. 10 cmの培養皿に1 x 10⁷細胞/10 mLを播種し、M-CSF 100 ng/mLを加えます。M-CSFの最終濃度は、培地100 ng/mLです。培養物を37°C、5%CO₂で3日間インキュベートします。
2. 3日後、培地を取り出し、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を激しく洗浄して非接着性細胞を除去し、PBSに5 mLの室温0.02%トリプシン-EDTAを加え、37°C、5%CO₂で5分間インキュベー
トします。
3. 徹底的なピペッティングで細胞を分離します。顕微鏡で培養物を観察して、細胞が剥離したことを確認します(細胞は丸みを帯びていて、培地に浮いているように見えるはずです)。細胞が付着したままの場合は、ピペッティングをよく繰り返して細胞を切り離します。細胞が剥離したら、5 mLのα-MEMを加えて反応を不活性化します。
4. 細胞を50 mLのコニカルチューブに集め、300 x gで5分間遠心分離し、上清を捨て、5 mLのα-MEMで洗浄します。
5. 300 x gで5分間遠心分離し、ペレットを10 mLのα-MEMに再懸濁します。
6. セルカウントを実行します。
7. 10 cmの培養皿に1 x 10⁶細胞/10 mLを播種し、M-CSF 100 ng/mLを加えます。M-CSFの最終濃度は、培地100 ng/mLです。培養物を37°C、5%CO₂で3日間インキュベートします。

2. 破骨細胞前駆体としてのBMMからの破骨細胞の生成

1. 3日後、ステップ1.2〜1.7に従って、破骨細胞前駆体としてBMMを表す付着細胞を採取します。
2. 96ウェルプレート中の5 x 10⁴細胞/200 μLのα-MEMでBMMを播種します。RANKLを添加して最終濃度を50 ng/mLにするか、TNF-αを添加して最終濃度を100 ng/mLにします。各ウェルに最終濃度が100 ng/mLになるようにM-CSFを添加します。
3. 抗c-fms抗体(最終濃度0、1、10、100、1000 ng/mL)を各ウェルに添加します。
4. 37°C、5%CO₂で4日間インキュベートします。4日間、隔日でメディアを交換します。

>3. 酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色

1. 4日間のインキュベーション後、各ウェルの培地を穏やかに吸引します。各ウェルを200μLの室温1x PBSで1回洗浄します。
2. 各ウェルに200 μLの10%ホルマリンを加えて固定し、室温で1時間インキュベートします。ホルマリンを吸引し、脱イオン水で各ウェルを3回洗浄します。
3. PBS中の0.2% Triton X-100 200 μLを各ウェルに添加して透過処理し、室温で1時間インキュベートします。Triton X-100を吸引し、各ウェルを脱イオン水で3回洗浄します。
4. 各ウェルに200 μLのTRAP染色液を加えます。顕微鏡で汚れを視覚化します。汚れが適切に発達するまでに10〜30分かかります。
5. 汚れを吸引し、脱イオン水で各ウェルを3回洗い、風乾します。室温で保管して、さらに観察に使用してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗c-Fms抗体			AFS98、ラットモノクローナル、抗マウス、c-Fms抗体(IgG2a)
ランクル	ペプロテック	315から11	組換えマウスsRANKリガンド、出典:E.coli
M-CSFの			10 cm懸濁培養皿中の5X106細胞におけるCMG14–12細胞株培養上清の1/10 vol.
α-MEM	和光		L-グルタミンとフェノールレッド
ウシ胎児血清	バイオウエスト	S1820-500	ウシ胎児血清フランス起源
カルチャーディッシュ	コーニング		100mm×20mmスタイルのディッシュ
96ウェルプレート	サーモフィッシャーサイエンティフィック		ヌン・クローン・デルタ表面