成虫のハエにおける宿主とウイルスの相互作用を研究するための胸腔内ウイルスナノ注射

要約

出典:Yang, S., et al.ショウジョウバエメラノガスターにおけるウイルス感染の確立と宿主-ウイルス相互作用の解析。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、ポジティブセンスの一本鎖RNAウイルスを成体の雄のショウジョウバエにナノインジェクションする手順を説明し、その後、感染によって開始される抗ウイルス反応を研究します。ポリメラーゼ連鎖反応解析により、感染したハエの特定の遺伝子のアップレギュレーションが同定され、RNA干渉やJAK/STATシグナル伝達などの免疫応答経路の活性化が示唆されます。

プロトコル

1. ショウジョウバエのウイルス感染

1. ナノインジェクションでハエを感染させ、サバイバルアッセイを行います。
   1. 毛細血管を引っ張って注射針を準備し、注射針にオイルを埋め戻し、注射器を組み立てます。
   2. 麻酔は、_CO2の軽い流れの下でパッド上を飛んでいます。50.6 nLのウイルス溶液(100 PFU、Tris-HCl緩衝液で希釈、pH 7.2)を胸腔内注射してハエに接種します。少なくとも3バイアルのハエを注入します(バイアルあたり20匹のハエ).
      手記：注射には時間がかかり(通常、1時間あたり100回のフライ)、ショウジョウバエCウイルス(DCV)の複製は非常に速いため、各バイアル(20フライ)が終了したら、チューブに正確な時間を書き留めることが非常に重要です。バッファのみのインジェクションは、モックコントロールとして設定されます。通常、オスの成虫のハエが好まれますが、これは、交配および繁殖中のホルモンの変動がメスの読み取りに影響を与える可能性があるため、メスを使用した場合よりも結果が安定して再現性が高いためです。
   3. 注入したハエを25°C、湿度60%で通常の明暗サイクルで成長させます。毎日新鮮な食べ物をハエに供給し、死んだハエの数を記録します。
   4. 少なくとも 3 回の生物学的反復を実行し、生存曲線をプロットします。
   5. 生存データの統計解析では、統計ソフトウェアを使用してKaplan-Meier生存曲線を生成します。ログランク検定を実行して、P 値を計算します。生存表で、各被験者の情報を入力します。次に、ソフトウェアは各時間での生存率を計算し、Kaplan-Meier 生存プロットをプロットします。
      手記：バイアルに酵母を追加しないでください。.模擬対照と比較して、DCVに感染したハエは時折腹水を持ち、不器用であるため、粘着性のある酵母に対して脆弱です。予備実験でより多くの時点を記録して、感染したハエの大量死が起こる時間枠を見つける方が良いでしょう。一般的に、感染したハエが最初の2日以内に死ぬことはめったになく、Dicer-2変異株であってもそうです。ボルバキアフリーのw1118(Bloomington 5905)ハエが100PFUのDCVに感染した場合、この時間枠は感染後約3〜5日です。注射後0.5時間以内に死亡したショウジョウバエは、ウイルス感染ではなく針の損傷によって死亡する可能性があるため、死亡者としてカウントしないでください。

2. 細胞変性効果(CPE)アッセイによるDCV負荷測定

1. 1日目に、ステップ1.1.1-1.1.2で説明されているようにオスのハエに感染させます。注入されたハエを20匹のグループにグループ化し、新鮮なフライフードで希望の時間(通常は24時間または3日間)成長させます。毎日新鮮な食べ物をハエに提供します。
2. 2日目に、10 cmの細胞培養皿にショウジョウバエS2*細胞を約5 x10⁶〜1x10⁷細胞/mLの密度で播種します。
3. 3日目に、5匹のハエを(_CO2の軽い流れの下で)収集し、ホモジナイザーを使用して200μLのTrisバッファーとセラミックビーズを使用して、1.5mLの遠心分離チューブで30秒間粉砕します。サンプルを-80°Cで保存するか、すぐに次のステップに進みます。
4. サンプルを徹底的にボルテックスします。1 mLシリンジと0.22 μmフィルターを使用して、上清を新しい1.5 mLチューブにろ過します。
5. S2*細胞用の完全培地で上清を10倍段階に連続希釈します。50 μLの希釈液をウェルに加えます。ウイルスを含まない50μLの培地を、ネガティブコントロールウェルとして分類されたウェルに加えます。
   手記：各希釈速度について、8ウェルを使用しました。一般的なDCVの収量は約10^{8-10 9} PFU/mLであるため、希釈は少なくとも~10-5-10-10^{をカバーする}必要があります。
6. 4日目は、20倍または40倍の対物レンズを備えた明視野顕微鏡でCPEを観察します。細胞がぼやけて見え、培地が断片でいっぱいのウェルを「ポジティブウェル」として分類し、細胞形態が正常なウェルを「ネガティブウェル」として分類します。
7. CPEのポジティブウェルまたはネガティブウェルをそれぞれ+または-でマークします。ウイルス組織培養の平均感染線量(TCID₅₀)を計算します。

>3. qRT-PCRで測定したDCV負荷

1. 1日目に、上記のようにハエを感染させます。オスのハエ(20匹/グループ)を注射し、新鮮なハエの餌で希望の時間、通常は24時間または3日間成長させます。毎日新鮮な食べ物をハエに提供します。
2. 3日目に、200 μLの溶解バッファーと20個のセラミックビーズ(直径= 0.5 mm)を含む1.5 mLチューブに_CO2の軽い流れで5匹のハエを採取し、ホモジナイザーで30秒間高速でサンプルを粉砕します。各チューブに800 μLの溶解バッファーを追加し、サンプルを-80°Cで保存するか、すぐにRNA抽出とqRT-PCRを行います。
3. RNaseフリーのチップ、チューブ、脱イオン、ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理、0.22 μmの膜ろ過水を準備します。200 μLのクロロホルム(≥99.5%)をサンプルに加え、手で15秒間激しく振とうします。水相と有機相が明確に分離するまで、室温で5分以上インキュベートします
   手記：クロロホルムは非常に危険であり、取り扱いには注意が必要です。DNA汚染のリスクを高めるため、サンプルをボルテックスしないでください。
4. サンプルを13,000 x gで4°Cで15分間遠心分離します。
5. 400 μLの上清を収集し、上清を新しいチューブに移します。同量のイソプロパノール(≥99.5%)と混合し、サンプルを手で20回穏やかに反転させた後、室温で10分以上沈殿させます
   手記：-20°Cでの沈殿は、RNAの収量を増加させます。
6. サンプルを13,000 x g、4°Cで10分間遠心分離します。チューブの底に白色RNAペレットが見えます。
7. 上清を捨て、70%エタノール(DEPC水中のエタノール)1mLを加え、数回反転させてRNAを洗浄します。
8. サンプルを13,000 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清と乾燥RNAを5〜10分間廃棄します。RNAは透明になるはずです。
9. 50 μLのDEPC水をサンプルに加え、数回ピペットで動かし、ボルテックスします。
10. RNA濃度を滴定するために3μLのRNAを服用してください。260 nmでRNAを定量します。通常、このプロトコルで抽出されるRNA濃度は約100-500μg/μLであり、これはcDNA合成に適しています。
11. cDNA合成には2μgのRNAを使用します。サンプルをddH₂Oで100 μLに希釈し、-20°Cで保存します。
12. 製造元の指示に従ってqRT-PCRを実行し、qRT-PCR.
    を実行します。 手記：DCVのcDNA合成には、ランダムプライマーがPoly Aプライマーよりもはるかに効果的でした。DCV mRNAの発現は、内因性リボソームタンパク質49(rp49)mRNAに正規化されます。この部分で使用するオリゴヌクレオチドプライマー:
    rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (フォワード) and
    5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (リバース);
    DCV、5' TCATCGTATGCACATTGCT 3' (フォワード) および
    5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (リバース);
    vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (前方) and
    5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (リバース);
    ウイルス誘導性RNA 1 (vir-1) 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (forward) and
    5' GATTACAGCTGGGTGCACAA 3' (リバース)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
顕微鏡	オリンポス	CKX41
Nanoject II オートナノリットルインジェクター	ドラモンドサイエンティフィック	3-000-204	Nanoject II 可変容量 (2.3 to 69 nL) ガラスキャピラリー付き自動インジェクター (110V)
シュナイダーの昆虫媒体	シグマ	S9895	細胞培養
10cm細胞培養皿	シグマ	CLS430167	細胞培養
ショウジョウバエインキュベーター	パーシバル	I-41NL	ショウジョウバエの飼育
0.22umフィルター	ミリポア	SLGP033RS
1.5 ml マイクロ遠心チューブ	ブランド	352070
1.5 ml RNaseフリー微量遠心チューブ	アクシゲン	MCT-150-Cシリーズ
ABI 7500 qPCR システム	アビー	7500	リアルタイムqPCR
遠心機	エッペンドルフ	5810R型
遠心機	エッペンドルフ	5424Rの
クロロホルム	シグマ	151858	RNA抽出
DEPC 水	シグマ	95284-100ミリリットル	RNA抽出
イソプロピルアルコール	シグマ	I9516	RNA抽出
Lysis buffer(RNA抽出)	サーモフィッシャー	15596026	トリゾール試薬
Lysis buffer(液体サンプルRNA抽出)	サーモフィッシャー	10296028	トリゾールLS試薬
光学接着フィルム	アビー	4360954	リアルタイムqPCR
ペニシリン-ストレプトマイシン、液体	インビトゲン	15140-122	細胞培養
qPCRプレート	アビー	A32811 (英語	リアルタイムqPCR
統計ソフト	GraphPad プリズム 7
TransScript Fly First-Straand cDNA合成 SuperMix	トランススクリプト	AT301	RNA抽出
渦動	イカ	ボルテックス3	RNA抽出
FBSの	インビトゲン	12657から029	細胞培養
平底96ウェルプレート	シグマ	CLS3922	細胞培養
セルインキュベーター	三洋電機	MIR-553
100本の交換用チューブ	ドラモンドサイエンティフィック	3-000-203-G/X

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