動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. マウスとDSSの準備
- ノックアウト(α-gustducin-/-)マウスと年齢、性別、体重が一致した野生型コントロール(α-gustducin+/+)C57BL/6マウスを個別に清潔なケージに保管してください
手記： ノックアウトマウスは、20世代以上にわたってC57BL/6マウスと戻し交配されており、ほぼ100%のC57BL/6遺伝的背景を持っています。
- 30 gのデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)粉末を1 Lのオートクレーブ水に溶解します。溶液が透明になるまで混合して、最終作業濃度が3%(w / v)であることを確認します
手記：DSS溶液は、室温で最大1週間、または使用するまで4°Cで保存できます。
>2. マウスにおけるDSS大腸炎の誘導と評価
- 各マウスの初期体重を量り、記録します。マウスを個別に標準的なプラスチック製ケージに入れ、ケージにラベルを付けます。
- 通常の飲料水を3%DSS溶液に交換し、マウスの両方のグループが自由にアクセスできる合計7日間
。
- マウスの体重を測定し、DSS溶液の消費量を記録し、DSS投与中に各マウスの便を毎日収集して検査します。下痢と直腸出血の重症度を観察し、これをDSS誘発性疾患指数に変換します。
- 実験中、初期体重と比較した体重減少の割合と疾患指数を計算して、大腸炎の症状を評価します.
手記： 疾患指数は、下痢と直腸出血の観察結果を組み合わせて採点され、0(正常な便、血液なし)、1(軟便、血液なし)、2(軟便、少量)、3(非常に軟便、中程度の出血)、および4(水様便、重大な出血)として定義されます。疾患指数は、マウスごとに毎日分析されます。
- 7日間のDSS治療の終わりまでに、子宮頸部脱臼によってマウスを犠牲にし、残りの実験を進めます。
>3. 組織サンプルの準備
- マウスを仰臥位に置き、腹部の皮膚を70%エタノールで洗浄します。腹部に長さ3cmの正中線切開を小さなハサミで行い、腹腔を露出させます。
- 一対の鉗子を使用して脾臓を他の組織から慎重に分離し、次に脾臓を取り出してそのサイズを測定します。
- 鉗子で結腸を特定して持ち上げ、周囲の腸間膜から分離します。盲腸と直腸が見えるまで結腸全体を引き出します。
- 結腸を大腸盲縁と骨盤の深部で横断して結腸を分離し、それぞれ近位結腸と遠位結腸を解放します。次に、分離された結腸の長さを測定して記録します。解剖処置中に結腸組織を傷つけないように注意してください。
- 強制針を備えた10mLのシリンジを使用して、10mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で結腸を洗い流し、溶出液が完全に透明になるまで糞便と血液を取り除きます。
- 組織学的同定のために、組織サンプルを近位、中位、遠位の3つの部分に均等に分割します。次に、組織を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で4°Cで一晩固定します。
>4. DSS誘発性大腸炎の重症度の組織学的評価
- ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色
- 固定後、組織を1x PBSの30%スクロース溶液に15 mLチューブで一晩浸し、サンプルを凍結保護します。
- 組織を最適な切断温度(OCT)コンパウンドに埋め込み、OCTが硬化するまで-20°Cに置きます。
- 組織を含むOCTブロックをクライオスタットに移し、クライオスタットの厚さダイヤルを12 μmに設定し、厚さ12 μmの凍結切片をスライスして収集します。
- クライオスタットから採取した組織切片を65°Cでホットプレート上で20分間加熱します。
- 切片を蒸留水で短時間洗います。ヘマトキシリン染色液で5分間染色し、続いて水道水で5分間すすぎます。
- 0.5%塩酸-エタノールで切片を30秒間区別し、流水で1分間すすぎます。次に、1x PBSで1分間洗浄し、続いて水道水で5分間すすぎます。
- 組織切片を70%、75%、80%、95%アルコールでそれぞれ10秒間洗浄し、エオシン染色溶液で2分間対比染色します。
- 95%アルコールと2回の無水アルコール交換で毎回5分間脱水を行います。キシレンを2回交換して5分間クリアします。
- 上記のH&E染色の結果に基づいて、遺伝子ノックアウト群と野生型群の両方について、各マウスの近位結腸、中結腸、および遠位結腸の組織損傷をスコアリングします。
手記：疾患指数は、粘膜、粘膜下組織、筋筋、および漿膜領域における上皮損傷と炎症の合計スコアであり、0(組織損傷および炎症なし)、1(限局性組織損傷および炎症)、2(斑状組織損傷および炎症)、および3(びまん性組織損傷および炎症)として定義されます。次に、結腸の近位部、中央部、および遠位部のマウスあたり3つのスコアを合計して、各動物の合計スコアを取得します。次に、各グループの平均スコアが計算されます。
