ヒト単球由来マクロファージにおけるカスパーゼ活性化の可視化

Abstract

出典:Bolívar, B. E., et. al., Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (2022).

このビデオは、二分子蛍光相補レポータータンパク質を使用して、ヒトマクロファージのカスパーゼタンパク質の活性化を示しています。カスパーゼ-1のプロドメインは、Venusタンパク質の非蛍光フラグメントと融合しており、Venusタンパク質はインフラマソーム複合体に動員されます。インフラマソームの近接性は、Venusフラグメントのリフォールディングと蛍光を誘導し、マクロファージにおけるカスパーゼの活性化を確認します。

Protocol

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. ヒト単球の単離とマクロファージへの分化

1. 地域の血液銀行で匿名化された健康な個人から抗凝固血液を取得し、以下に示すように末梢血単核細胞(PBMC)を分離します。
   手記：組織培養層流フードですべてのステップを実行します。滅菌チューブのみを使用し、手袋を着用してください。廃棄時には、すべての血液関連製品に10%の漂白剤を加えてください。滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(1x)またはダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)(Ca²⁺およびMg²⁺なし)は、同じ意味で使用できます。
   1. 希釈バッファーを調製する:1x 滅菌PBSに2%ウシ胎児血清(FBS)および0.5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加します。
   2. 培地の準備:RPMI-1640培地にFBS(10%(v/v))、グルタマックス(2 mM)、ペニシリン/ストレプトマイシン(50 I.U./50 μg/mL)を添加
   します
   3. メーカーのプロトコルに従って、ランニングバッファー(材料の表)を予冷します。
   4. 全血を2容量の希釈バッファーで希釈します。血清ピペットを使....

Results

図1:実験ワークフローの概略図概要。

図2:CD14単球の分化とヒトMDMのトランスフェクション(A)分化の1日目、3日目、4日目、7日目にGM-CSFにばく露した末梢血由来のCD14+単球の代表的な明視野画像(スケールバー、100μm)。(B-C)ヒトMDMは、カスパーゼ-1 pro-BiFCペアとトランスフェクションレポーターdsRedmito(50 ng、赤)でトランスフェクションしまし.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
48ウェル組織培養2:34プレート	ジェネシー・サイエンティフィック	25〜108
10cmティッシュカルチャーディッシュ	VWRの	25382-166
2メルカプトエタノール1000x	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21985023
8ウェルチャンバーカバーガラス、1.5HPカバーガラス	セルビス	c8-1.5H-N
AutoMACS カラム	ミルテニー(バイオテック)	〒130-021-101	AutoMACS Pro Separatorのみを使用した自動分離
AutoMACS Proセパレーター	ミルテニー(バイオテック)	〒130-092-545	AutoMACS Pro Separatorのみを使用した自動分離
AutoMACS Pro洗浄液	ミルテニー(バイオテック)	〒130-092-987	AutoMACS Pro Separatorのみを使用した自動分離
AutoMACSリンスソリューション	ミルテニー(バイオテック)	〒130-091-222	AutoMACS Pro Separatorのみを使用した自動分離
AutoMacsランニングバッファ	ミルテニー(バイオテック)	〒130-091-221	QuadroMACSまたはAutoMACS pro Separatorを使用した手動または自動分離
Axio Observer Z1 電動倒立顕微鏡 CSU-X1A 5000 スピニングディスクユニット	ツァイス		568 nm(RFP)および488または512 nm(GFPまたはYFP)の波長のレーザーラインを備えたレーザーモジュールを備えた共焦点顕微鏡であれば、どれでも使用できます
AxioObserver A1、研究グレードの倒立顕微鏡	ツァイス		568 nm(RFP)および488または512 nm(GFPまたはYFP)の波長を励起できる蛍光フィルターを備えた落射蛍光顕微鏡であれば、どれでも使用できます
CD14+マイクロビーズ	ミルテニー(バイオテック)	〒130-050-201	QuadroMACSまたはAutoMACS pro Separatorを使用した手動または自動分離
塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まないDPBS	シグマ	D8537-6x500ミリリットル
DsRed水戸プラスミド	クロンテック	632421	蛍光レポーターとして使用できる同様のプラスミドは、Addgeneで見つけることができます
ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL	シグマ	GE17-1440-02
GlutaMAX サプリメント (100x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	35050079
GM-CSFの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PHC2011
豚由来のHemin BioXtra、INSERT CHARACTR96.0%(HPLC)	シグマ	51280から1G
ヘープス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15630106
炎症性カスパーゼBiFCプラスミド			LBHラボからのリクエストにより利用可能
LPS-EBウルトラピュア	インビボゲン	TLRL-3PELPSの
LSカラム	ミルテニー(バイオテック)	〒130-042-401	QuadroMACS セパレータのみを使用した手動分離
MACS 15 mLチューブラック	ミルテニー(バイオテック)	〒130-091-052	QuadroMACS セパレータのみを使用した手動分離
MACSマルチスタンド	ミルテニー(バイオテック)	〒130-042-303	QuadroMACS セパレータのみを使用した手動分離
mCherryプラスミド	Yungpeng Wang ラボ		蛍光レポーターとして使用できる同様のプラスミドは、Addgeneで見つけることができます
ネオントランスフェクションシステム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	MPK5000	ネオンエレクトロポレーション装置、ピペット、ピペットステーションが含まれています
ネオントランスフェクションシステム 10 μL キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	MPK1096	再懸濁バッファー R、再懸濁バッファー T、電解バッファー E、96 x 10 μL ネオンチップ、ネオンエレクトロポレーションチューブを含む
ニゲリシンナトリウム塩、既製溶液	シグマ	SML1779-1ML
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩	シグマ	P7280-5mg
QuadroMACS セパレータ	ミルテニー(バイオテック)	〒130-090-976	QuadroMACS セパレータのみを使用した手動分離
qVD-OPh	フィッシャー(ApexBio)	〒50-101-3172
RPMI 1640 ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11875119
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25200072
UltraPure 0.5 M EDTA、pH 8.0	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15575020