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人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。
1. ヒト単球の単離とマクロファージへの分化
- 地域の血液銀行で匿名化された健康な個人から抗凝固血液を取得し、以下に示すように末梢血単核細胞(PBMC)を分離します。
手記：組織培養層流フードですべてのステップを実行します。滅菌チューブのみを使用し、手袋を着用してください。廃棄時には、すべての血液関連製品に10%の漂白剤を加えてください。滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(1x)またはダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)(Ca2+およびMg2+なし)は、同じ意味で使用できます。
- 希釈バッファーを調製する:1x 滅菌PBSに2%ウシ胎児血清(FBS)および0.5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加します。
- 培地の準備:RPMI-1640培地にFBS(10%(v/v))、グルタマックス(2 mM)、ペニシリン/ストレプトマイシン(50 I.U./50 μg/mL)を添加
します
- メーカーのプロトコルに従って、ランニングバッファー(材料の表)を予冷します。
- 全血を2容量の希釈バッファーで希釈します。血清ピペットを使用して、抗凝固血液15 mLを希釈バッファー30 mLの入った50 mLチューブに移します。反転させてやさしく混ぜます。
- 全血10 mLまたは希釈血液30 mLごとに、密度勾配培地15 mLを50 mLの空のチューブに加えます。
- ステップ 1.1.5 の密度勾配培地を、25 mL の血清ピペットを使用して、希釈した血液 30 mL とゆっくりと着実に重ね合わせます。ピペットの先端をチューブの壁に当て、チューブを傾けた角度に保ちます。
- チューブをスイングバケット遠心分離機に慎重に移します。2つのフェーズを乱さないでください。チューブを400 x g、室温(RT)で25分間遠心分離し、加速と減速を最小値に設定します。
- 10 mLピペットを使用して上部の(透明な)血漿層を慎重に除去し、漂白剤(10%)の入った容器に廃棄します。.
- 末梢血単核細胞(PBMC、図1)の期間(白色)層を10 mLピペットで採取し、新しい50 mLチューブに移します。同じドナーの異なるチューブからの白い層を、最大30mLの50mLチューブに組み合わせます。
- ステップ1.1.1の希釈バッファーで各チューブを合計容量50 mLにし、300 x g、4°Cで10分間遠心分離します。上清を10 mLピペットで除去し、漂白剤(10%)の入った容器に廃棄します。
- p1000マイクロピペットを使用して、ステップ1.1.3で予熱したランニングバッファー1 mLに各細胞ペレットを再懸濁します。同じドナーからの細胞懸濁液を新しい15 mLチューブに混ぜ合わせます。予冷したランニングバッファーで各チューブの容量を15 mLにし、反転してよく混合します。
- ステップ1.1.11の細胞懸濁液の20 μLアリコートを取り出し、1x 滅菌PBSを使用して1:100希釈液を調製します。血球計算盤を使用して細胞数を決定します。
- ステップ1.1.11の細胞懸濁液を300 x g、4°Cで10分間遠心分離し、10 mLピペットで上清を除去します。必要に応じて、p200マイクロピペットを使用して上清を完全に取り除きます。
- 1 x 107セルごとに、80 μLの予冷済みMACSランニングバッファーに単離されたPBMCを再懸濁し、最大800 μLのバッファーを追加します。
- 1 x 107細胞ごとに20 μLの抗ヒトCD14 MicroBeadsを添加するか、血液サンプル(~100 mLの未希釈血液)あたり最大100 μLを添加します。反転させてよく混合し、チューブローテーターに20分間置き、4°Cで連続的に混合します。
- チューブローテーターからサンプルを取り出し、各チューブに10 mLの予冷済みランニングバッファーを加え、300 x g(加速=5、減速=5)および4°Cで10分間遠心分離します。
- 10 mLピペットで上清を除去し、500 μLの予冷済みランニングバッファー(2 x 108/mL)に最大1 x 108細胞を再懸濁します。
- CD14陽性細胞の単離は、製造元の指示に従って、手動または自動システム(Table of Materials)を使用して磁気細胞選別によって行ってください。
- CD14陽性選択後、ステップ1.1.18の細胞懸濁液の20 μLアリコートを採取し、1x 滅菌PBSを使用して1:100希釈液を調製します。血球計算盤で細胞をカウントして、細胞番号を決定します。
- CD14陽性細胞を300 x gで遠心分離し、室温で10分間室温で10分間、10 mLピペットまたは真空システムを使用して上清を除去します。
- ステップ1.1.20の細胞ペレットを、ステップ1.1.2の予熱した培地に再懸濁し、最終細胞密度1 x 107細胞/mLまで再懸濁します。
- 単離されたCD14陽性単球を5 x 106細胞の細胞密度で播種する。
- 10 cmの組織培養皿に、ステップ1.1.2の培地10 mLに50 ng/mLの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)を添加して加えます。
- ステップ1.1.21の細胞懸濁液0.5 mLを培地に滴下し、プレートを静かに渦巻かせます。加湿組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で細胞を一晩インキュベートします。
- 翌日、真空システムを使用して培地を吸引し、一晩で付着しなかった細胞を除去します。GM-CSF(50 ng/mL)を添加した新鮮培地10 mLを添加し、加湿組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で細胞を7日間インキュベートして、完全分化させます(GM-CSFのさまざまな分化段階でのCD14+単球の出現については、図2Aを参照)。培地は2〜3日ごとに交換し、毎回新鮮なGM-CSF(50 ng / mL)を補給します。
2. エレクトロポレーション部品の準備
>注:このプロトコルは、10 μL-Neonチップ用に設計されています(材料表)。各トランスフェクションには、1-2 x 105細胞を使用します。トランスフェクションした細胞は、48ウェルプレートまたは8ウェルチャンバーディッシュ(1ウェルあたり10 μL-トランスフェクション細胞)に播種することをお勧めします。1x 滅菌DPBS(Ca2+およびMg2+なし)をPBSの代わりに使用できます。
- 7日目に、RPMI-1640培地にFBS(10%(v / v))とグルタマックス(2 mM)を補充して、抗生物質を含まない培地を調製します。
- 無血清のRPMI-1640培地、トリプシン-EDTA(0.25%)溶液、1x滅菌PBS(Ca2+およびMg2+なし)、およびステップ1.1.2の完全な培地を37°Cの水浴に入れます。
- ガラス底のディッシュ(共焦点顕微鏡用)を使用する場合は、ディッシュをポリ-D-リジン臭化水素酸塩でコーティングします。
- 8ウェルチャンバーのディッシュに200 μLのポリ-D-リジン臭化水素酸塩(1x滅菌PBS中0.1 mg/mL)をコーティングし、室温で5分間インキュベー
トします。
- ポリ-D-リジン溶液を吸引し、ガラスを1x滅菌PBSで1回洗浄します。PBSを吸引し、手順2.4に進みます。
- 48ウェルプレートまたは8ウェルチャンバーディッシュのウェルあたり200 μLの抗生物質フリー培地を添加し、加湿組織培養インキュベーター(37°C、5% CO2)でトランスフェクション細胞をプレートする準備ができるまでプレインキュベー
トします。
3. エレクトロポレーション用細胞の調製
>注:7日間の分化期間の終了時に10cmのディッシュからMDMの収量は約1.5 x 106細胞です。PBSの代わりに1x滅菌DPBS(Ca2+およびMg2+なし)を使用できます。このプロトコールは、ほとんどのマクロファージが細胞の生存率と完全性を維持しながらプレートから分離するように最適化されています。MDMは細胞培養プレートから取り外すのが困難です。したがって、セルを解離するために、ステップ3.2と3.3を2回実行する必要がある場合があります。トリプシン-EDTA(0.25%)による各インキュベーション時間が5分を超えないようにしてください。
- 10 cmの皿で完全に分化したマクロファージから培地を吸引し、温かい無血清のRPMI-1640培地で細胞単層を洗浄します。メディアを完全に取り除いてください。
- 10 cmディッシュあたり2 mLの温かいトリプシン-EDTA(0.25%)溶液を加えて細胞を回収し、加湿組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で5分間インキュベー
トします。
- p1000マイクロピペットを使用して、トリプシン-EDTA(0.25%)溶液をディッシュ領域全体にわたって上下に穏やかにピペッティングすることにより、細胞剥離を完了します。ステップ1.1.2の温かい完全培地5 mLが入った15 mLの円錐形チューブに細胞懸濁液を移します。
- ディッシュを明視野顕微鏡に持って行き、さまざまな視野で細胞の剥離を確認します。まだかなりの量のセルが付着している場合は、手順3.2〜3.3を繰り返します。
- 細胞懸濁液を250 x gでRTで5分間遠心分離します。
- 培地を吸引し、37°Cに予熱した1x滅菌PBS10 mLに細胞を再懸濁します。20 μLのアリコートを服用し、血球計算盤を使用して細胞数を決定します。
- 意図したトランスフェクションごとに1-2 x 105細胞を取り込み、15 mLチューブに入れます。予め温めた1x滅菌PBSで最終容量15mLにします。250 x gでRTで5分間遠心分離します。
- PBSを吸引し、250 x gで1分間もう一度遠心分離します。p200マイクロピペットを使用して、細胞ペレットから残留PBSを除去します。
>4. ヒト単球由来マクロファージへのカスパーゼBiFC成分のヌクレオフェクション
>注:プロトコールのこのセクションは、ネオントランスフェクションシステム(材料表)を使用して実行されます。このプロトコールでは、10 μL ネオンチップを使用して 1-2 x 105 細胞をトランスフェクションする手順を概説しています (材料表)。100 μL ネオンチップを使用する場合は、それに応じてスケールアップしてください。細胞を15分以上再懸濁バッファーRにさらすと、細胞の生存率とトランスフェクション効率が低下する可能性があるため、避けてください。
- レポータープラスミド(mCherryまたはdsRedmitoを100 ng/μL)で希釈し、ヌクレアーゼフリー水または0.5倍TEバッファーでトランスフェクションした細胞を可視化します。
- カスパーゼBiFCプラスミドをヌクレアーゼフリー水または0.5倍TEバッファーで適切な濃度に希釈し、プラスミドの総量が10 μLの総トランスフェクション容量(つまり、C1 Pro-VCの300 ng/μLおよびC1 Pro-VNの300 ng/μL)の30%を超えないようにします。
- 意図したトランスフェクションごとに1.5 mLの滅菌マイクロチューブを調製し、適切な量のレポータープラスミド(50 ngまたは0.5 μL)およびカスパーゼBiFCプラスミド(300 ngまたは1 μLのC1 Pro-VCおよび300 ngまたは1 μLのC1 Pro-VNフラグメント)を加えます。マイクロチューブは常にフードに入れてください。
- ピペットステーション、デバイス、チップ、エレクトロポレーションチューブ、およびピペットを滅菌層流フードに入れます.
手記：ピペットステーション、デバイス、チップ、エレクトロポレーションチューブ、ピペットは、Neon Transfectionシステムに含まれています。
- ハイボリュームを接続しますtageピペットステーションのセンサーコネクタは、製造元の指示に従ってデバイスの背面ポートに接続します。ピペットステーションをデバイスの近くに保管してください。
- 電源コードを背面のACインレットに接続し、デバイスをコンセントに接続します。電源スイッチを押して、デバイスの電源を入れます。
- デバイスの電源がオンになり、適切に接続されたときに表示される起動画面にトランスフェクションパラメータを入力します。Voltageを押して1000と入力し、Doneを押して電圧を1000 Vに設定します。Widthを押して40を入力し、Doneを押してパルス幅を40ミリ秒に設定します。最後に、#Pulsesを押して2を入力し、Doneを押して電気パルスの数を2に設定します。
- エレクトロポレーションチューブ(キットに付属)の1つを取り、RTで3mLの電解バッファーE(10μLチップ用でキットに付属)を充填します。チューブの側面にある電極が内側を向いていること、およびチューブを挿入するときにカチッという音が聞こえることを確認します。
- ステップ3.8のセルペレットを取り出し、1-2 x 105細胞ごとに10 μLの予熱済み再懸濁Rバッファー(キットに付属)を加えます。p20マイクロピペットでやさしく混ぜます。ステップ4.3でセットアップした各チューブに10 μLの細胞懸濁液を加え、p20マイクロピペットで穏やかに混合します。
- ピペットを取り、2番目のストップのプッシュボタンを押してチップを挿入します。クランプが先端のピストンの取り付けステムを完全に掴み、ピペットの上部ヘッドに隙間が観察されていないことを確認してください。
- サンプルを吸引するには、ピペットのプッシュボタンを押して最初のストップまで押し、細胞/プラスミドDNA混合物を含む最初のチューブに浸します。混合物をゆっくりとピペットチップに吸引します.
手記：気泡はエレクトロポレーション中にアーク放電を引き起こす可能性があり、デバイスによって検出された場合、電気パルスの送達を妨げる可能性があるため、気泡は避けてください。気泡が観察された場合は、内容物をチューブに放出し、再度吸引してみてください。
- サンプルを入れたピペットをピペットホルダーに非常に慎重に挿入します。ピペットがカチッと音を立て、正しく配置されていることを確認してください。
- タッチスクリーンのスタートを押して、電気パルスが配信されるまで待ちます。画面上のメッセージは完了を示します。
- ステーションからピペットをゆっくりと取り外し、ステップ2.4から事前に温めた抗生物質を含まない培地を使用して、トランスフェクションした細胞懸濁液を対応するウェルにすぐに追加します><。
手記：このチップは、同じプラスミドに対して最大3回再利用できます。それ以外の場合は、プッシュボタンを押して2番目のストップまで押して、バイオハザード廃棄物コンテナに捨てます。
- 細胞/プラスミドDNA混合物を含む各チューブについて、ステップ4.10〜4.14を繰り返します。
- トランスフェクションした細胞でプレートを穏やかに揺さぶり、加湿組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で1〜3時間インキュベー
トします。
- ステップ1.1.2で調製した温めた培地(完全培地)を各ウェル200 μLに加えます。ディッシュを加湿した組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に再度入れます。遺伝子発現には少なくとも24時間かかります。
- 翌日、落射蛍光顕微鏡を使用して細胞生存率とトランスフェクション効率を検査します。
- メーカーの指示に従って落射蛍光顕微鏡と蛍光光源ボックスの電源を入れ、培養皿を顕微鏡ステージに置きます。
- 10倍または20倍の対物レンズと568 nm(RFP)フィルターを選択します。
- 細胞生存率を推定するには、透過光LED(TL)ボタンを押して、選択したフィールド内のすべての細胞を視覚化します。顕微鏡の接眼レンズを覗き込みながら、細胞が観察されるまでフォーカスノブを回し、選択したフィールドで細胞の付着を確認します
手記：完全に付着した細胞は生存可能な細胞を表し、浮遊細胞は生存不可能な細胞を表します。ウェルのコンフルエント度が高い場合、非接着細胞の存在は、生存率が低い結果ではなく、細胞数の過大評価の結果である可能性があります。しかし、浮遊細胞の含有量が高いことに伴う低いコンフルエンテーションは、エレクトロポレーション中のアーク放電、プラスミド毒性、または再懸濁Rバッファーへの過剰曝露に起因する生存率が低いことを意味します。後者の動作を示すウェルは使用しないでください。
- トランスフェクション効率を推定するには、上記のように透過光下で選択したフィールドの細胞に焦点を当てます。選択したフィールドのセルの総数をカウントします。透過光LED(TL)を消灯した状態で、反射光LEDボタン(RL)を押してスイッチを入れます。
- レポーター遺伝子蛍光(赤血球)に微細に着目し、赤色蛍光細胞の総数をカウントします。ウェルごとに少なくともさらに2つのフィールドについて、これらの手順(4.18.4-4.18.5)を繰り返します。
5. トランスフェクションMDMとカスパーゼBiFCデータ取得の取り扱い
>注:落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して細胞をイメージングする予定の場合は、選択した刺激による治療の前にqVD-OPh(20μM)で1時間処理することが、カスパーゼ依存性細胞死(主にアポトーシス)を防ぐために推奨されます。これは、アポトーシスによる細胞の浮き上がりを防ぐためのイメージングに使用され、細胞が焦点面から移動する際のイメージングを非常に困難にします。活性化プラットフォームおよび関連するカスパーゼBiFCへのカスパーゼ動員は、カスパーゼの触媒活性に依存しないため、カスパーゼ阻害はこのステップに影響を与えないことに注意してください。
- トランスフェクションの約24時間後に選択した刺激で治療し、各薬物に必要な限りインキュベートします。
- ステップ1.1.2の培地にHepes(20 mM、pH 7.2-7.5)および2-メルカプトエタノール(55 μM)を添加して、イメージング培地を調製します。
- 予め温めたイメージング媒体に所望の濃度の刺激を加え、穏やかに混合します。
- p1000マイクロピペットで培地を細胞から慎重に取り出し、ステップ5.1.2の刺激溶液500μLをウェルの側面に加えます。
- 未処理のコントロールウェルを泳動するには、刺激を含まないイメージング培地を追加します。
- 加湿組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で、各処理で示される限り細胞をインキュベー
トします。
- 落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して細胞を視覚化します。
- 製造元の指示に従って、顕微鏡と蛍光灯の電源を入れます。
- 10倍または20倍の対物レンズを選択し、培養皿を顕微鏡ステージに置きます。
- 顕微鏡の接眼レンズを使用して、568 nmフィルターの下の細胞を見つけ、dsRedmito/mCherryレポーターを発現する細胞(赤血球)に焦点を合わせます。
- 視野内のすべての赤いセルを数え、数を記録します。
- 同じ視野で、488または512フィルター(GFPまたはYFP)に変更し、緑色(金星陽性またはBiFC陽性)の赤色細胞の数をカウントし、その数を記録します。
- 少なくとも 3 つの個々の視野から少なくとも 100 個の dsRedmito/mCherry 陽性細胞を数えます。
