宿主と微生物叢の相互作用を研究するためのex vivo腸管臓器培養システム

要約

出典:Azriel, S., et al.宿主と微生物叢の相互作用を分析するための腸管臓器培養システム。J. Vis. Exp. (2021年)。

このビデオでは、マウスの腸組織断片と特定の腸内細菌との相互作用を研究するためのex vivo腸内臓器培養システムのセットアップ方法について説明します。このデバイスは、2対の入出力ポートで構成されており、1つ目は腸組織の内腔を接続して特定の細菌懸濁液を供給し、もう1つはデバイスのウェルに培地を継続的に供給してex vivo組織の生存率を維持します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 実験の準備

1. 腸管臓器培養装置の作製(3日間)
   1. 3Dプリンターを使用して、臓器培養装置(装置には6つのウェルがあり、24の大小の穴があり、装置カバーの蓋用)用の再利用可能なプラスチック型を印刷します
      注:これらのプラスチック金型は、多数のデバイスの製造に使用できます。
   2. 鈍端の針(22 Gおよび18 G)をデバイス金型内の適切な位置に挿入し、約20 gのポリジメチルシロキサン(PDMS)混合物(1:10の重量比、塩基と触媒)を1セットのデバイスと蓋にキャストします。
   3. 金型を真空チャンバーに30分間置き、PDMS混合物から気泡を取り除きます。
   4. 金型を55°Cで一晩インキュベートし、PDMS重合を完了します。
   5. PDMSをセットしたら、針を型から引き出し、培養装置と蓋をプラスチック型から慎重に外します。
   6. PDMSの残留物をサージカルブレードを使用してウェルアウトラインから除去します。PDMSデバイスとデバイスカバーを、無毒のシリコン接着剤を使用してカバーガラス(75 mm x 50 mmマイクロスライド)に取り付け、部品を一晩放置します(デバイスの滑らかな面に接着剤を塗布します)。
   7. 内腔に22G針を12本、ウェルに18G針を12本挿入します。シリコンを使用してすべての針を所定の位置に固定し、一晩セットします。2本の18G針をカバー蓋に挿入して、腸内臓器培養装置に適切な空気が行き来します。
   8. 水で満たされた注射器を使用して、すべての針に漏れがないか確認します。井戸に水を入れて、井戸から漏れがないことを確認します。
   9. 結腸に接続される各22G針に2つの外科的結び目を置きます。デバイスと蓋をオートクレーブ紙袋に入れ、オートクレーブで滅菌します。
2. 培地(0.5時間)
   1. 生物学的フードで、以下を混合します(50 mLチューブ内):37 mLのIscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)、10 mLのKSR血清補充、1 mLのB27サプリメント、0.5 mLのN2サプリメント、0.5 mLの1 M HEPESバッファー、および0.5 mLの非必須アミノ酸
   。
   2. ろ過し、完全な培地を4°Cで保存します。
3. チューブと手術器具の準備
   1. インプットルーメン、インプットウェル、アウトプットルーメン、アウトプットウェル(短いチューブ12本、長いチューブ12本)に適した長さのチューブをカットします。チューブの両側に適切なアダプターを接続します。
   2. 手術器具を準備します:まっすぐなハサミ、4倍の細い鉗子、2つの鋭い鉗子。
   3. チューブと手術器具をオートクレーブ紙袋に入れ、オートクレーブを使用して滅菌します。
4. 管腔入力(必要な刺激-細菌、便、薬物など)を準備します。
   1. 実験の前に、細菌培養物の細菌負荷を段階希釈法で測定し、好気性および/または嫌気性条件下で培養します。
   2. 細菌負荷を計算した後、細菌培養物を滅菌組織培養培地で希釈して、必要な細菌濃度を得ます。糞便サンプルの場合は、100μmのストレーナーを使用してろ過します.
      手記：非細菌性刺激(薬物、代謝物など)の場合は、腸管培養培地を用いて物質を必要な濃度に希釈します。

>2. 実験セットアップの準備

1. 臓器培養インキュベーター内で、ヒーターユニットの電源を入れ、37°Cに設定します。
2. ポンプ、入力シリンジ、出力シリンジをセットアップします。
3. 組織培養培地への投入
   1. 生物学的または層流フードで、インプットウェルシリンジに完全な培地を充填します。最終的な容量は、実験の期間と流量によって異なります。通常、1 mL/hとパージ用の追加の培地。
   2. Luer-lockアダプターを使用してチューブをシリンジに接続します。充填されたシリンジをシリンジポンプに入れます。
   3. 入力シリンジをパージします。ウェルメディウムがすべてのチューブから廃ガラスに流れ出ていることを確認してください。
4. 管腔入力
   1. 管腔入力シリンジに刺激治療(細菌、薬物など)を充填します。容量は、実験の期間と流速(通常は30 μL/hとパージ用の追加培地)によって異なります。
   2. Luer-lockアダプターを使用してチューブをシリンジに接続します。充填されたシリンジをシリンジポンプに入れます。
   3. 入力シリンジをパージします。刺激がすべてのチューブから廃ガラスに流れ込むことを確認してください。さまざまな刺激を汚染しないように注意してください。
5. 出力
   1. 空のシリンジを出力シリンジポンプに入れます(ポンプモードを「引き出し」に設定します)。
6. デバイスのセットアップ
   1. 混合ガス(95%_O2 + 5%_CO2)の流量を制御するレギュレーターを、穏やかで最小限の流量に設定します。
   2. 層流フードでデバイスを調べます。
   3. デバイスの針を滅菌IMDMで洗い流し、針を洗います。
   4. 500 μLの滅菌培地をデバイスの各ウェルに加えます。
7. 組織解剖の準備
   1. 滅菌手術器具を層流フードの中に入れます。
   2. 10mLシリンジに滅菌IMDMを充填し、滅菌(オートクレーブ滅菌)の22G鈍端針を接続して結腸を洗い流します。

3. オルガン文化

1. マウスの犠牲と組織解剖
   1. 層流フードで、12〜14日齢のマウスを斬首して犠牲にします。マウスに70%エタノールをスプレーし、プラスチックプレートの上に置きます。
   2. 鋭利なハサミと鉗子を使ってマウスを解剖し、脂肪と結合組織をすべて切開して胃から肛門までの消化管を取り出します。結腸を切って新しいプレートに置きます.
      手記：結腸組織との接触を最小限に抑えます。結腸組織の中央部分に触れないでください。ティッシュを優しく、ティッシュの端だけに保持します。
2. コロンフラッシュとウォッシュ
   1. 解剖顕微鏡下で、調製した10mLシリンジ(ステップ2.7.2)を使用して、滅菌IMDMで結腸内容物を(近位側に)穏やかに洗い流します。腸組織から糞便を取り除いた後、0.5mLの滅菌IMDMで満たされた新しい6ウェルプレートに結腸を置きます。
3. 結腸をデバイスに接続する
   1. ティッシュを取り、22Gの針に慎重に接続し、2本の糸でしっかりと結びます。この時点で、内腔の流れに対する結腸の正しい向きを維持することが不可欠です(近位=入力、遠位=出力)。6つの組織すべてについて手順3.2〜3.3を繰り返します。
   2. 入力ニードルのルアーロックが媒体から空であることを確認します。そうでない場合は、空にします。入力針ルアーロックに刺激を加えます(内腔への気泡の侵入を防ぐため)。適切な刺激で各結腸についてこの手順を繰り返します。
   3. すべてのティッシュが接続されていることを確認し、カバーの蓋をデバイスの上に置きます。
4. 臓器培養装置とポンプの接続
   1. デバイスを予熱された温度制御チャンバー(37°C)に入れます。
5. ガスフローを接続する
   1. 適切な入力針を使用して、ガスアダプターをカバー蓋に接続します。
   2. 入力管と出力管をデバイスに接続します.
      手記： 近位結腸側を入力槽に接続します。
6. 刺激入力で内腔をパージします。
   1. 腸内刺激を穏やかに流し、出力チューブ内の中程度の流れを確認します。
   2. 外部媒体を洗浄します。
   3. 外部媒体を3回洗浄します(ポンプを入力ウェルと出力ウェルの両方で600μL / minの速度に設定します)。各洗浄には1分かかります(井戸を空にすることから始まります)。
7. 実験を開始します。
   1. 次の速度でポンプを始動します:
      流量:ルーメン:入力-30μL / h、出力-35μL / h
      外部媒体:入力-1000μL/h、出力-950μL/h
      手記： 実験時間は30分から24時間の間で変動します。
8. 実験終了(結腸臓器培養の場合は最大24時間)
   1. デバイスからすべてのチューブを外します。
   2. 組織を針から切り離し、目的の読み出しに進みます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
デバイス
18ゲージブラントニードル	マクマスター	75165a754
22ゲージブラントニードル	マクマスター	75165a758
万能接着剤シーラント100%シリコーン	DAPの	688
キュービック真空デシケーターVDC-21 + 2シェルフ		AAAD4021
スライドガラス 厚さ 1mm	コーニング	2947-75X50
ミニインキュベーター im-10		AAH24315K
MPC 301E真空ポンプ		VI-412711
プラスチッククイックターンチューブカップリングプラグ	マクマスター	51525k121
プラスチッククイックターンチューブカップリングソケット	マクマスター	52525k211
シルガード184シリコーンエラストマー	ダウ		ポリジメチルシロキサン、PDMS
チューブ	マクマスター	6516トン11
ゾートラックスM200	ゾートラックス		Zortrax Z-SUITE、Autodesk Fusion 360
Zortrax M200材料:z-ultrat	ゾートラックス
中程度
B27サプリメント(50x)、無血清T	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504044
イスコーブのモディファイドダルベッコのミディアムとフェノールレッド(1x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12440061
HEPESバッファー(1M)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15630056
ノックアウトセラム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10828028
N2サプリメント(100x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1370701
非必須アミノ酸 (100x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11140035
手術用ツール
大型ハサミ	アセルテック	11月00日10
シャープ鉗子	F.S.T(エフエスティー)	11297から10
シルク編み込み外科用糸	SMIの	8010グラム
ストレートハサミ	F.S.T(エフエスティー)	14091から09
細い鉗子	F.S.T(エフエスティー)	11051から10
臓器系
0.1μmフィルター	生命遺伝子
0.22 μm フィルター	生命遺伝子
5 mL ルアーロックシリンジ	B-Dさん	309649
グリーノー実体顕微鏡	ツァイス	ステミ305
循環式精密エアヒーター「CUBE」		キューブ-2-リス
シリンジポンプ	ニューエラポンプシステムズ株式会社	NEP-NE-1600-EM

名 の の 日 シリーズ