細胞内染色およびフローサイトメトリーによるサイトカイン産生に対するタバコ製品調製物の影響の解析

要約

出典:Arimilli, S. et al., 可燃性タバコ製品調製物の細胞毒性および免疫抑制を評価する方法.J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオは、フローサイトメトリーを使用して、ヒト末梢血単核細胞からのサイトカイン産生に対するタバコ製品調製物(TPP)の効果を示しています。TPPによる細胞の処理は、炎症誘発性サイトカインの産生をダウンレギュレートし、これはリポ多糖刺激後に推定され、その後の免疫染色およびフローサイトメトリー分析後に推定されます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. WS-CMの準備

1. 前述のように、全煙調整媒体(WS-CM)を生成します。
   次の
   1. 喫煙法を使用して、フェノールレッドを含まないロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640培地に4本の3R4F参照タバコからの煙を通過させることにより、WS-CMを準備します:35-60-2、パフボリューム(ml)、パフインターバル(秒)、パフデュレーション(秒)、それぞれ。各調製物は20mlのサンプルを生成します。
2. チューブに日付、完了した時間、タバコの名前と番号をラベル付けします。500μlのアリコートは、喫煙終了後すぐに-80°Cで保存してください。
3. 凍結WS-CMのアリコートを分析して、前述のニコチン、タバコ特異的ニトロソアミン、および多環芳香族炭化水素のレベルを決定します。

2. 末梢血単核細胞、PBMCSの単離

1. 健康なドナー(タバコ製品の非消費者)から新鮮な血液を採取する:以下に説明するように、新鮮な血液からPBMCを分離します。
   1. 血液バッグが到着する前に、500 mLのボトル、はさみ、分離バッファー、およびダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)(RT)をバイオセーフティレベル2(BSL-2)細胞培養フードに用意してください。分離バッファーは光から保護する必要があります。
   2. 血液バッグを逆さまに持ち、チューブを固定した場所のすぐ下に切断し、チューブを少なくとも3cm残します。
   3. 500mlボトルからキャップを取り外し、チューブをボトル開口部の上に保持します。血液バッグを拾い上げて反転させ、バッグが空になるまで血液がバッグからボトルに自由に流れるようにします。気泡が発生しないように、血液がボトルの内壁に流れるのではなく、まっすぐに流れるようにします。
   4. アイソレーションバッファーを血液に対するアイソレーションバッファーの比率1:5でボトルに注ぎます。ボトルにしっかりと蓋をし、ゆっくりとひっくり返します。ボトルを細胞培養フードに入れ、ライトを消しながらRTで1時間インキュベー
   トします。
   5. 血液の上に薄い麦わら色の層が蓄積します。25 mLの血清ピペットを使用して、この層を50 mLのコニカルチューブに取り除きます。収集量は、献血した被験者によって50〜300mlの範囲で異なります。
   6. チューブを200 x gでRTで10分間遠心分離します。
   7. 半透明の上清を吸引し、暗い血色のペレットを残します。ペレットは緩いですが、粘性があります。
   8. 3 mLのアイソレーションバッファーを15 mLのコニカルチューブにピペットで移します。
   9. 再懸濁したペレットに、ステップ2.1.5で収集した麦わら色の液体50 mlごとに20 mlのDPBSを追加します。ボルテックスで十分に混合し、複数のチューブから再懸濁した液体を統合します。この液体には懸濁血球が含まれています。
   10. トランスファーピペットを使用して、ステップ2.1.8で5 mLの懸濁血球を3 mLの分離バッファーに移します。細胞懸濁液を含む15mlの円錐管をゆっくりと穏やかに傾けて、2つの別々の層を作成します。チューブを400 x gで40分間、RTで最小限の加速とブレーキなしで遠心分離します。
   11. トランスファーピペットを使用して、PBMCを含む曇った中間層(バフィーコート)を50mlのコニカルチューブに取り除きます。その下に他の明確なレイヤーを描画することは避けてください。各50mlの円錐管に25ml以下を移します。
   12. 25 mLのコールドランニングバッファー(または50 mLのコニカルチューブの残りの容量全体を満たすためにそれ以上)を加えて細胞を洗浄します。細胞を400 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
   13. ペレットを10 mLのランニングバッファーで再懸濁します。細胞を数えてすぐに使用するか、氷の上に置いて凍結します。

3. PBMCの凍結融解

1. ステップ2.1.13で採取したエリフェラル血液単核細胞(PBMC)を400 x gで10分間遠心分離します。
2. 製造元の指示に従って、冷凍容器にイソプロピルアルコールを入れます.
   注意：イソプロピルアルコールは可燃性で急性毒性があります。
3. 20%ウシ胎児血清(FBS)と10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含むRPMI 1640培地(4°C)でペレットを再懸濁します。これはRPMI 1640凍結媒体です。ペレットを凍結培地の量で再懸濁すると、約5 x 10⁷細胞/ mlの懸濁液が得られます。フリーズに使用できるセルの数は異なります。
4. 1 mLの細胞懸濁液を2 mLのクライオチューブに分注し、クライオチューブを凍結容器に入れます。クライオチューブ付きの冷凍容器を-80°Cの冷凍庫に入れてO / Nを保管し、次にクライオチューブを取り外して-150°Cから-190°Cの極低温冷凍庫に移します。
5. クライオチューブを極低温保存から取り出し、37°Cの水浴中で穏やかに攪拌しながら急速に解凍します。
6. クライオチューブ内の解凍したPBMCを、10%FBS、1%のペン/連鎖球菌、および1%のL-グルタミンを含む10 mLのRPMI 1640完全培地(4°C)を入れた15 mLのコニカルチューブに直ちに移します。解凍したクライオチューブの内容物は、細胞生存率を最大限に引き出すために、できるだけ早く移す必要があります。
7. PBMCを400 x gで10分間遠心分離します。
8. ペレットを5 mLのRPMI 1640完全培地で再懸濁し、細胞をカウントします。
9. トリパンブルー排除法などの確立された方法により、細胞生存率を測定します。一般に、この方法による細胞生存率は約90〜95%です。これで、PBMCを実験で使用する準備が整いました。

>4. 細胞内染色とフローサイトメトリー

>注:ここにリストされている希釈液は、この研究のためのものです。希釈液はそれに応じて調整することができます。

1. RPMI完全培地を使用して、WS-CMを96ウェルプレートで、0.3、1.56、3、および5μg/mlの等ニコチン単位の濃度で、総容量100μl/ウェルに希釈します。
2. 同じプレートで、ニコチンを次の濃度に希釈します:2、10、50、100、500、2000、および4000μg/ml
   注意：ニコチンは急性毒性があり、環境に有害です。
3. RPMI完全培地に懸濁したPBMC100 μlを1 ×^{10 6}細胞/ウェルの濃度で添加します。細胞とWS-CMまたはニコチンの合計容量は200μl/ウェルになります。
4. プレートを覆い、37°Cおよび5%CO₂で3時間インキュベー
トします。
5. 300 × gで3分間遠心分離し、上清を吸引し、プレートを覆った状態でプレートの底をボルテックスし、最後に200 μlの氷冷ランニングバッファーで細胞を再懸濁して、RTで細胞を洗浄し、洗浄ステップをもう一度繰り返します。
6. 200 μlのRPMIコンプリートメディウムをプレートに加え、洗浄ステップをもう一度繰り返します。
7. RPMI完全培地を使用して、2 μl/ml GolgiPlug と 10 μg/ml LPS の使用濃度を調製し、各ウェルに 200 μl を加えます。
8. プレートを37°Cおよび5%CO₂で6時間インキュベートします。
9. ステップ9.8の最後に、細胞をランニングバッファー(4°C)で洗浄し、300 x gで4°Cで3分間遠心します。
10. 各ウェルに100 μlのCytofixを加え、4°Cで20分間インキュベー
トします。
11. ステップ9.9で説明したように、1x Permwash(4°C)で300 x g、4°Cで3分間、細胞を3回洗浄します。
12. 各ウェルに45 μLの1x Cytopermを添加し、続いて各ウェルにTNF-α-Alexa Fluor 488、IFN-γ V500、MIP-1α PEのいずれか1つの抗体をそれぞれ5 μL加えます。4°Cで30分間インキュベートします。
13. ステップ9.9で説明したように、細胞を1x Permwash(4°C)で2回洗浄し、1回はランニングバッファー(4°C)で300 x gで4°Cで3分間洗浄します。
14. 細胞を200 μlの2%パラホルムアルデヒド (4 °C) で再懸濁します。細胞を12mm×75mmのチューブに移し、フローサイトメーターでサンプルを分析します
    注意：パラホルムアルデヒドは腐食性で、急性毒性があり、健康に害を及ぼします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12 X 75チューブ	BDファルコン	352058
15mlコニカルチューブ	コーニング	430790
2 mLマイクロチューブ	アクシゲン	MCT-150-C-S型
3R4Fリファレンスシガレット	ケンタッキー大学農学部	3R4F
50mlコニカルチューブ	コーニング	430828
500mlボトル	コーニング	430282
96ウェルフラットボトムプレート	テルモ・ヌンク	439454
細胞培養フード	サーモサイエンティフィック	1300 シリーズ A2
遠心機	エッペンドルフ	58110Rの
Cytofix/Cytoperm(パーマウォッシュ)	BDバイオサイエンス	555028	可燃 性
FBSの	シグマ・アルドリッチ	F2442
フィルターユニット	ナルゲン	〒156-4020
フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	FACSカントII	Ex 405とEm785の8色。
フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	FACSカリバー	Ex 495とEm 785の4色。
フローサイトメトリー解析ソフトウェア	ツリースター	フロージョ
冷凍コンテナ	ナルゲン	〒5100-0001	DMSOを含み、刺激性
ゴグリプラグ	BDバイオサイエンス	555029	発がん性物質、刺激性、腐食性
IFN-γ V-500 抗体	BDホライゾン	561980	皮膚感作性物質
アイソレーションバッファ	Isolymph、CTLサイエンティフィックコーポレーション	1114868	引火性液体、刺激性
イソプロピルアルコール	シグマ・アルドリッチ	W292907
L-グルタミン	ギブコライフテクノロジーズ	〒25030-081
組合	シグマ・アルドリッチ	L2630
MIP1-α PE 抗体	BDファーミンゲン	554730	急性毒性、経口
ニコチン	シグマ・アルドリッチ	N3876	急性毒性、環境ハザード
パラフィルム	ビーミス	「M」
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	P6148	可燃性、皮膚刺激性
ペン/連鎖球菌	ギブコライフテクノロジーズ	15140-122
RPMIの1640	ギブコライフテクノロジーズ	11875-093
ランニングバッファ	MACSランニングバッファー、Miltenyi Biotech	〒130-091-221
TNF-α Alexa Fluor 488 抗体	バイオレジェンド	502915
トランスファーピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-711-20

さん 型