細胞内染色およびフローサイトメトリーによるサイトカイン産生に対するタバコ製品調製物の影響の解析

要約

出典:Arimilli, S. et al., 可燃性タバコ製品調製物の細胞毒性および免疫抑制を評価する方法.J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオは、フローサイトメトリーを使用して、ヒト末梢血単核細胞からのサイトカイン産生に対するタバコ製品調製物(TPP)の効果を示しています。TPPによる細胞の処理は、炎症誘発性サイトカインの産生をダウンレギュレートし、これはリポ多糖刺激後に推定され、その後の免疫染色およびフローサイトメトリー分析後に推定されます。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. WS-CMの準備

1. 前述のように、全煙調整媒体(WS-CM)を生成します。
   次の
   1. 喫煙法を使用して、フェノールレッドを含まないロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640培地に4本の3R4F参照タバコからの煙を通過させることにより、WS-CMを準備します:35-60-2、パフボリューム(ml)、パフインターバル(秒)、パフデュレーション(秒)、それぞれ。各調製物は20mlのサンプルを生成します。
2. チューブに日付、完了した時間、タバコの名前と番号をラベル付けします。500μlのアリコートは、喫煙終了後すぐに-80°Cで保存してください。
3. 凍結WS-CMのアリコートを分析して、前述のニコチン、タバコ特異的ニトロソアミン、および多環芳香族炭化水素のレベルを決定します。

2. 末梢血単核細胞、PBMCSの単離

1. 健康なドナー(タバコ製品の非消費者)から新鮮な血液を採取する:以下に説明するように、新鮮な血液からPBMCを分離します。
   1. 血液バッグが到着....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12 X 75チューブ	BDファルコン	352058
15mlコニカルチューブ	コーニング	430790
2 mLマイクロチューブ	アクシゲン	MCT-150-C-S型
3R4Fリファレンスシガレット	ケンタッキー大学農学部	3R4F
50mlコニカルチューブ	コーニング	430828
500mlボトル	コーニング	430282
96ウェルフラットボトムプレート	テルモ・ヌンク	439454
細胞培養フード	サーモサイエンティフィック	1300 シリーズ A2
遠心機	エッペンドルフ	58110Rの
Cytofix/Cytoperm(パーマウォッシュ)	BDバイオサイエンス	555028	可燃 性
FBSの	シグマ・アルドリッチ	F2442
フィルターユニット	ナルゲン	〒156-4020
フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	FACSカントII	Ex 405とEm785の8色。
フローサイトメーター	BDバイオサイエンス	FACSカリバー	Ex 495とEm 785の4色。
フローサイトメトリー解析ソフトウェア	ツリースター	フロージョ
冷凍コンテナ	ナルゲン	〒5100-0001	DMSOを含み、刺激性
ゴグリプラグ	BDバイオサイエンス	555029	発がん性物質、刺激性、腐食性
IFN-γ V-500 抗体	BDホライゾン	561980	皮膚感作性物質
アイソレーションバッファ	Isolymph、CTLサイエンティフィックコーポレーション	1114868	引火性液体、刺激性
イソプロピルアルコール	シグマ・アルドリッチ	W292907
L-グルタミン	ギブコライフテクノロジーズ	〒25030-081
組合	シグマ・アルドリッチ	L2630
MIP1-α PE 抗体	BDファーミンゲン	554730	急性毒性、経口
ニコチン	シグマ・アルドリッチ	N3876	急性毒性、環境ハザード
パラフィルム	ビーミス	「M」
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	P6148	可燃性、皮膚刺激性
ペン/連鎖球菌	ギブコライフテクノロジーズ	15140-122
RPMIの1640	ギブコライフテクノロジーズ	11875-093
ランニングバッファ	MACSランニングバッファー、Miltenyi Biotech	〒130-091-221
TNF-α Alexa Fluor 488 抗体	バイオレジェンド	502915
トランスファーピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-711-20

さん 型