黄色ブドウ球菌によるin vitroバイオフィルム合成

1. in vitroバイオフィルムの作製

1. 凍結保存されたストックから、トリプシン大豆寒天培地などの栄養豊富な寒天プレート上のストリークプレート技術を使用して、黄色ブドウ球菌の単離コロニーを取得します(材料の表を参照)。
2. 96ウェルプレートの各ウェルに、滅菌H₂Oで希釈した0.001%(v/v)ポリ-L-リジン(PLL)100 μLでコーティングし、室温で30分間インキュベートします。無菌的に、真空アシスト吸引トラップを使用してPLL溶液を吸引します。ウェルを室温で一晩乾かします.
   手記：プロトコルのすべての吸引ステップは、特に明記されていない限り、真空支援吸引トラップを使用して実行されます。
3. 黄色ブドウ球菌のコロニーに2%グルコースを添加した最小必須培地アルファ(MEMα)に接種して一晩培養し、37°Cでインキュベートし、200rpmで16〜18時間振とうします。
4. 2%グルコースを添加した新鮮なMEMαを50μLから5mLに移して一晩培養し、37°Cでインキュベートし、200rpmで振とうしながら、対数相の中間まで、一般に光学密度600(OD_600nm)が0.5〜0.8の間になるまでインキュベートします。MEMαを使用して、中対数培養をOD_600nmの0.1に正規化します。
5. 150 μLの正規化した培養物を、PLL 処理した 96 ウェルプレートの各ウェルに移します。加湿チャンバー内で37°C.
   で18-20時間静的にインキュベートします。 手記： バイオフィルムは、μチャンネルスライドなどの他の形式で成長させることもできます(材料の表を参照)。
6. 上清を吸引して、浮遊細胞を除去します。残りのバイオマスを150μLのハンクス平衡塩溶液(HBSS)で優しく洗浄し、付着していない細胞を取り除きます。バイオフィルムの破壊を避けるために、HBSSをドロップワイズに加えます.
   手記： 洗浄中に上清とHBSSを吸引しながら、バイオフィルムを含むウェルにバイオフィルムが浸漬されたままになるのに十分な液体(上清またはHBSS)を残します。これにより、HBSSを滴下に添加してバイオフィルムを洗浄する際に、バイオフィルムの構造が乱れるのを防ぐことができます。
7. 手順1.6を少なくともさらに2回繰り返して、すべての浮遊細胞を削除します。この時点で、バイオフィルムはすぐに下流の実験を行う準備ができています
   手記：バイオフィルムを好中球実験に使用しない場合は、HBSSをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で代用できます。HBSSは、好中球の活性化に最適な条件を提供するグルコースを含む成分を含んでいるため、PBSよりもHBSSが好まれます。