病原菌を介してリンパ球を刺激するIn Vitro技術

要約

出典:Dousha, L., et al. インフルエンザ菌に対する呼吸器免疫応答の評価。 J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオは、型指定不可能なインフルエンザ菌(NTHi)を介してリンパ球を刺激し、免疫応答を評価するin vitro技術を示しています。単離された末梢血単核細胞(PBMC)をNTHiとインキュベートすると、細菌細胞はTリンパ球を刺激し、サイトカイン産生につながります。サイトカインの分泌を阻害すると、免疫蛍光染色を行い、刺激されたTリンパ球に蓄積された細胞内サイトカインを検出します。

プロトコル

1. 抗原製剤

>注:Hiに対する免疫応答を評価するために、3つの異なる抗原製剤を使用することができます。これらは、1)細胞内成分(通常は細菌の細胞壁から)です。2)死滅した細菌と不活化細菌。3)生きているバクテリア。実験を開始する前に、各抗原製剤の使用を決定します。

1. 細胞内成分
   1. 市販の調製物、自社開発の成分、および/または他の研究者から、細胞内成分を調達します
      手記：通常、細菌の細胞壁に由来する細胞内成分が使用され、P6やリポリゴ糖(LOS)などの外膜タンパク質が含まれる。これらの細胞内成分は、通常、特殊なセンターで生成されます。それらがどのように作られるかの説明は、この記事の範囲を超えています。これらのコンポーネントを入手するには、この分野の専門家と直接連絡することをお勧めします。
2. 死滅/不活化細菌
   1. 適切なサンプル(喀痰や気管支鏡検査など)から細菌を採取します。適切な微生物学研究室を使用して、株がH.インフルエンザ菌であることを確認してください。H. influenzaeサンプルのタイピングを行い、タイプ指定できないことを確認します(NTHi、専門の微生物学研究室による)。
   2. 代表的な抗原を得るためには、複数のNTHi株(少なくとも5株、それぞれほぼ同量)を用いてプール抗原を作製します。菌株を-70°Cでグリセロールブロスに微量遠心チューブで保存します
      手記：この実験では、10種類の異なる菌株を使用しました。
   3. 菌株(一度に1本の微量遠心チューブ)をチョコレート寒天プレートで解凍し、5% CO₂を含む37°Cのインキュベーターで一晩増殖させます。500 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に細菌を加え、2回洗浄します(300 x gで5分間遠心)。MacFarlandスタンダードまたは分光光度計を使用して、NTHiを10⁸ mLの濃度に分注します(5 mL容器または同等のものを使用)。
   4. バクテリアを56°Cの温度のウォーターバスに10分間入れて、バクテリアを不活化します。
   5. 連続超音波処理設定を使用して、低中速の速度で30秒間細菌を超音波処理します。
   6. 適量のサンプルを微量遠心チューブに分注します。10⁸ mLのサンプルの場合、50 μLのアリコート(つまり、1 mLあたり20サンプル)を使用し、必要になるまで-70°Cで凍結します。
3. 生きたバクテリア
   1. まず、ステップ1.2.1で述べたように、生きた細菌の特性評価を行います。十分に特徴付けられた1つの株を使用してください。菌株が-70°Cのグリセロールブロスにも予備として保存されていることを確認してください。
   2. バクテリアは、チョコレート寒天プレートなどの濃縮培地やブロスで増殖させます。
      1. チョコレート寒天プレートを使用するには、滅菌スプレッダーを使用して、最低3〜4日ごとに細菌を広げます。
      2. あるいは、第X因子(ヘミン)とV因子(β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)を豊富に含むブレインハートインフュージョン(BHI)ブロスを使用して、細菌を増殖させます。ヘミンとβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(両方とも10 μg/mL)を添加した5-10 mLのBHIブロスにオーバーナイトプレートからNTHiを接種し、5%_CO2インキュベーターで37°Cで一晩培養します><。 手記：これには、再現性、コロニー形成単位(CFU)数が多いこと、およびすべての細菌が対数増殖の同様の段階にあるという利点があります(プレート上では、培養物の位置に応じて細菌の生存率が高くなる可能性があります)。
   3. 1つの細胞に100種類の細菌の感染の多様性(MOI)を用いることで、細胞の生存率を維持しながら強力な免疫応答を誘発することができます。マクファーランドスタンダードまたは分光光度計を使用して、細菌の数を評価します。
   4. NTHiの生アッセイに使用する培地にヒト血清が含まれていないことを確認してください。動物血清サンプル(例:子牛胎児血清)は、一般的に問題を引き起こさない
      手記：末梢血、気管支鏡検査サンプル(特に気管支肺胞洗浄(BAL))、切除された肺組織などの標準的な組織サンプルを分析するには、以下に説明する方法を使用します。サンプルをHi抗原と10分から24時間以上インキュベー
   トします。

2. 末梢血中のリンパ球機能の評価

1. フローサイトメトリーアッセイには、全血または単核細胞製剤を使用してください。
2. 静脈穿刺によって各被験者からサンプルを取得します。末梢静脈から4 mLの血液をリチウムヘパリンチューブに採取し、サンプルをアリコートに分割して制御および抗原刺激を行います。
3. 共刺激抗体(抗CD28およびCD49d、1 μL/mL)を両方のサンプルに添加します。抗原サンプルにNTHiを添加し、37°Cおよび5%_CO2で1時間インキュベートします。死滅したNTHi調製物には、2mLの血液に200μLの抗原を加えます。生NTHiの場合、MOIが100:1の生きたNTHi細胞を白血球に加えます(血球計算盤で測定)。
4. ゴルジブロック剤ブレフェルジンA(10 μL/mL)をサンプルに加え、さらに5時間
   インキュベートします。 手記：ゴルジ体を遮断すると、サイトカインが細胞外に持ち出されるのを防ぐことができます。
5. 全血を使用する場合は、赤血球を0.8%塩化アンモニウムで溶解し、白血球のみを溶液中に残します。500 μL の 1%-2% パラホルムアルデヒドを使用して白血球を 1 時間固定します。
6. 血球計算盤で細胞をカウントし、10 μLの0.1%サポニンで10 μLの⁶細胞を15分間透過処理し、蛍光標識抗体で細胞をインキュベートします。細胞を洗浄し、フローサイトメーターを使用して分析します.
   手記：蛍光標識抗体の量は、各サイトカインに特異的です。製造元の指示に従ってください。通常、100 μLの溶液中の^{10 6}細胞を1時間染色します。市販されているほとんどの抗体は、25〜100回のテストを実行するのに十分です。
7. 図1に示すように、関連するリンパ球集団をゲーティングすることにより、抗原応答細胞の割合を決定します(細胞はCD45、次にCD3、その後CD4またはCD8の発現によってゲーティングされます)。非刺激細胞に対して、解析するすべてのサイトカインについてバックグラウンド染色を行います。100,000個の細胞をスクリーニングして、刺激された細胞とコントロールの両方について各サイトカインを分析します。

結果

図1:肺組織におけるサイトカイン産生。まず、フローサイトメトリーを用いて、白血球マーカーCD45(A)の発現について細胞を解析します。次に、この集団をCD3の発現(B)およびCD4/CD8の発現(C)についてさらに分析します。CD3/CD4+細胞は、コントロールサンプル(D)およびNTHi刺激サンプル(E)の細胞内サイトカイン産生について評価されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化アンモニウム	シグマ・アルドリッチ	213330
ブレフェルディン	シグマ・アルドリッチ	B6542
CD28	サーモフィッシャー	16-0289-81
CD49dの	サーモフィッシャー	534048
サポニン	シグマ・アルドリッチ	8047152

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