感染したヒト組織由来細胞における炎症性メディエーターの定量化

要約

出典:Dousha, L. et al., Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae.J. Vis. Exp.(2021年)

このビデオは、ヒトの肺組織由来免疫細胞をインフルエンザ菌とインキュベートすることにより、感染中の炎症メディエーターの定量化を示しています。フローサイトメトリーは、標識リンパ球のサイトカイン蛍光を測定するために使用され、細菌感染に応答した炎症誘発性サイトカインの産生と相関します。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. 抗原製剤

1. 生きたバクテリア
   1. まず、生きた細菌の特性評価を行います。適切なサンプル(喀痰や気管支鏡検査など)から細菌を採取します。適切な微生物学研究室を使用して、株がインフルエンザ菌であることを確認してください。インフルエンザ菌のサンプルのタイピングを行い、タイプ指定できないことを確認します(専門の微生物学研究室による)。十分に特徴付けられた1つの株を使用してください。菌株が-70°Cのグリセロールブロスにも予備として保存されていることを確認してください。
   2. バクテリアは、チョコレート寒天プレートなどの濃縮培地やブロスで増殖させます。
      1. チョコレート寒天プレートを使用するには、滅菌スプレッダーを使用して、最低3〜4日ごとに細菌を広げます。
      2. あるいは、第X因子(ヘミン)とV因子(β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)を豊富に含むブレインハートインフュージョン(BHI)ブロスを使用して、細菌を増殖させます。ヘミンとβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(どちらも10 μg/mL)を添加したBHIブロス5-10 mLに一晩プレートから非型型インフルエンザ菌(NTHi)を接種し、5%二酸化炭素_CO2インキュベーターで37°Cで一晩培養します><。 手記：これには、再現性、コロニー形成単位(CFU)数が多いこと、およびすべての細菌が対数増殖の同様の段階にあるという利点があります(プレート上では、培養物の位置に応じて細菌の生存率が高くなる可能性があります)。
   3. 1つの細胞に100種類の細菌の感染の多様性(MOI)を用いることで、細胞の生存率を維持しながら強力な免疫応答を誘発することができます。マクファーランドスタンダードまたは分光光度計を使用して、細菌の数を評価します。
   4. NTHiの生アッセイに使用する培地にヒト血清が含まれていないことを確認してください。動物血清サンプル(例えば、ウシ胎児血清)は、一般的に問題を引き起こさない><。 注:以下に説明する方法を使用して、末梢血、気管支鏡検査サンプル(特に気管支肺胞洗浄(BAL))、切除された肺組織などの標準的な組織サンプルを分析します。サンプルをHi抗原と10分から24時間以上インキュベー
   トします。

>2. 肺組織におけるリンパ球機能/炎症メディエーターの評価

1. 通常、気管支鏡検査から十分なリンパ球を得ることは不可能であるため、肺葉切除サンプルから肺組織を使用してください。肺組織サンプルの最適化には、解剖病理学サービスとの緊密な連携が必要です。組織の縁が腫瘍から少なくとも3 cm離れており、重大な肺気腫のない細胞組織であることを確認してください(病理医によって決定されます)。
2. 肺組織を細胞懸濁液に分解してから、フローサイトメトリーアッセイに使用します。肺組織を化学的に(コラゲナーゼなどで)消化するか、機械的に分解します。
   手記：組織の機械的脱凝集は、細胞のより良い表面染色(例えば、CD3/4標識)と関連しているため、好ましい場合があります。
   1. 病理医から肺葉切除サンプルを採取します(通常は肺がんの治療を受けている患者から採取します)。サンプルの約20〜40gを3〜5mmの³セクションにスライスします。それらを滅菌済みの50 μLチャンバー内に置いてから、適切なディスアグリゲーターを使用して機械的に断片化します。
   2. 組織分解後、赤血球を 10:1 (すなわち 5 mL) の 0.8% 塩化アンモニウム (150 mM 塩化アンモニウム (NH₄Cl)、1 mM 重炭酸ナトリウム (NaHCO₃)、および 0.1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 溶液で溶解します
      手記：あるいは、Q-prepなどの自動化システムを使用してもよい。
   3. 細胞を滅菌RPMI(容量は細胞数によって異なり、通常は10〜20 mL)に再懸濁し、100 μmの滅菌ナイロンメッシュでろ過します。トリパンブルー排除法を用いて生細胞の数をカウントします。

3. NTHi感染アッセイ

1. 肺細胞をチューブあたり4 x 10⁶細胞/mLの最終細胞濃度に再懸濁します(コントロールおよび刺激サンプル)。
2. (陰性)コントロールチューブには、1mLのRPMIに4 x 10^6-6 x 10⁶細胞の懸濁液を使用します。NTHiチューブに同量を使用します(追加のサンプルは、ブドウ球菌スーパー抗原E(SEB)のポジティブコントロールとして使用できます)。NTHiチューブ内の細胞を、細胞あたり100個の細菌のMOIで感染させます。キャップを半回転緩めて、チューブ内のガスが移動できるようにします。
3. 細胞をチューブローテーターに入れ、12 rpmで回転させながら37°Cでインキュベー
トします。
4. サイトカインの細胞外への移動を防ぐには、刺激の1時間後にゴルジブロッカー(ブレフェルジンA)を細胞懸濁液に添加し、最終濃度を10 μg/mLにします。細胞懸濁液を戻し、回転させてさらに16〜22時間のインキュベーションを行います。
5. 細胞懸濁液を、1%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.01%アジ化ナトリウム(NaN₃)を含む500 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
6. 細胞内サイトカイン染色用の抗体を添加します(抗体の選択は研究者が決定します)。細胞懸濁液を特定のヒトリンパ球細胞表面マーカー(CD45、CD3など)に1時間染色します。細胞をPBSで洗浄し、固定して透過化します。
7. 500 μLの1%-2%パラホルムアルデヒドを使用して細胞を1時間固定します。
8. 血球計算盤で細胞をカウントし、10 μLの0.1%サポニンで10 μLの⁶細胞を15分間透過処理し、蛍光標識抗体で細胞をインキュベートします。細胞を洗浄し、フローサイトメーターを使用して分析します.
   手記：蛍光標識抗体の量は、各サイトカインに特異的です。製造元の指示に従ってください。通常、100 μLの溶液中の^{10 6}細胞を1時間染色します。市販されているほとんどの抗体は、25〜100回のテストを実行するのに十分です。
9. 細胞内サイトカイン染色抗体(インターフェロン-γ、IFN-γおよび腫瘍壊死因子ベータ、TNF-αまたはインターロイキン、IL-13、IL-17Aなど)と細胞を1時間インキュベートします
   手記：最初に表面マーカーを染色し、次に細胞内で固定すると抗体が結合する表面タンパク質の立体構造が変化する可能性があるため、染色することをお勧めします。
10. 細胞を500 μLのPBSで洗浄し、100 μLのPBSに再懸濁してから、フローサイトメーターでデータを取得します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化アンモニウム	シグマ・アルドリッチ	213330
ブレフェルディン	シグマ・アルドリッチ	B6542
Filcon滅菌ナイロンメッシュ	ベクトン・ディキンソン	340606
ゼラチン基質、Enzchek	分子プローブ	E12055
MACSミックスチューブローテーター	ミルテニーバイオテック	〒130-090-753
メディマシン	ベクトン・ディキンソン		カタログ番号はありません
サポニン	シグマ・アルドリッチ	8047152