オプソニン化バイオフィルムとの相互作用による好中球によるROS産生の決定

要約

出典: Rana, P. S. J. B., et al. Standardized In vitro Assays to Visualize and Quantify Interactions between Human Neutrophils and Staphylococcus aureus Biofilms. J. Vis. Exp. (2022)

このビデオでは、オプソニン化された細菌のバイオフィルムに曝露された好中球による活性酸素種の生成を検出するin vitro化学発光アッセイを実演しています。

プロトコル

1. 好中球が産生するROSの測定

1. 洗浄したバイオフィルムに100 μLの20%正常ヒト血清(HBSSで希釈)を滴下し、静圧条件下で37°Cで30分間インキュベートしてバイオフィルムをオプソニン化します。
2. 20%血清溶液を吸引し、バイオフィルムを150μLのHBSSで一度滴下洗浄します。HBSSを吸引し、オプソナイズされたバイオフィルムを含むウェルを残します.
   手記： 実験の解釈には、(A)好中球+バイオフィルム、(B)好中球+PMA(ポジティブコントロール、材料表を参照)、(C)好中球のみ、および(D)バイオフィルムのみの4つのグループが推奨されます。
3. HBSSに再懸濁した好中球にルミノール(材料表を参照)を4 x 10⁶細胞/mLの濃度で添加し、最終的なルミノール濃度が50 μMになるようにします。このソリューションは、グループ (A) と (C) ですぐに使用できます。ルミノールと混合した4 x 10⁵好中球を、オプソニン化バイオフィルムを含むウェルに加えます。
4. 別のチューブで、好中球を含まないHBSS中の50μMルミノール溶液を調製し、バイオフィルムを含むウェル(グループD)に加えます。
5. 好中球350μLをルミノールと混合し、最終濃度500 ng/mLのホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)を混合物に加えます。グループ(B)については、この混合物から4 x 10⁵好中球をバイオフィルムのないウェルに加えます。これはポジティブコントロールとして機能します。
   手記： このステップで示されるPMAの濃度は、PMA刺激好中球がポジティブコントロールであるため、堅牢なバースト応答を確保するために比較的高くなっています。PMAは、実験によっては、好中球を活性化するために低濃度で使用できます。
6. プレートを270 x gで4°Cで30秒間遠心分離します。
7. プレートリーダーが37°Cに設定されていることを確認し、発光とキネティックリードの設定を3分間隔で60分間行います。プレートをプレートリーダーにセットして、好中球によるROS産生を60分間測定します
   手記：このアッセイでは、発光アッセイに使用した白色プレートでバイオフィルムを成長させました。PMAは、酸化バースト応答の既知のアゴニストです。PMAを含む研究を行う場合は、PMAがすぐにバースト応答を開始するため、好中球を含む溶液が冷えている間、最終ステップでPMAが追加されていることを確認してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
50 mLコニカル遠心チューブ	サーモサイエンティフィック	339652
アルコール綿棒	BDの		採血に使用
セルカウンター	バルサプライ	202C
クリアボトム96ウェル平底ポリスチレンプレート	共演者	3370
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)1x	ギブコ	14190-144
ハンクス平衡塩溶液(HBSS)1x	コーニングセルグロ	21-022-履歴書	カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし
血球計算盤	ブライトライン
ルミノール	シグマ	A8511-5G
ミニマルエッセンシャルメディア(MEM)アルファ1x	ギブコ	41061から029
正常なヒト血清	補完技術	NHSの
ペトリ皿(100 x 15 mm)	VWRの	25384-342
ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート
ポリ-L-リジン溶液	シグマ	P4707-50ミリリットル
SoftMax Proソフトウェア	分子デバイス		データ取得に使用するマイクロプレートリーダーソフトウェア
SpectraMax i3xの	分子デバイス		マイクロプレートリーダー

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