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1. in vitroバイオフィルムの作製
- 凍結保存されたストックから、トリプシン大豆寒天培地などの栄養豊富な寒天プレート上のストリークプレート技術を使用して、黄色ブドウ球菌の単離コロニーを取得します(材料の表を参照)。
- 96ウェルプレートの各ウェルに、滅菌H2Oで希釈した0.001%(v/v)ポリ-L-リジン(PLL)100 μLでコーティングし、室温で30分間インキュベートします。無菌的に、真空アシスト吸引トラップを使用してPLL溶液を吸引します。ウェルを室温で一晩乾かします.
手記：プロトコルのすべての吸引ステップは、特に明記されていない限り、真空支援吸引トラップを使用して実行されます。
- 黄色ブドウ球菌のコロニーに2%グルコースを添加した最小必須培地アルファ(MEMα)に接種して一晩培養し、37°Cでインキュベートし、200rpmで16〜18時間振とうします。
- 2%グルコースを添加した新鮮なMEMαを50 μLから5 mLに移して一晩培養液を希釈し、37 °Cでインキュベートし、200 rpmで振とうしながら、対数相の中間まで、通常は光学密度600(OD600nm)の0.5〜0.8の間までインキュベートします。MEMαを使用して、中対数培養をOD600nmの0.1に正規化します。
- 150 μLの正規化した培養物を、PLL 処理した 96 ウェルプレートの各ウェルに移します。加湿チャンバー内で37°C.
で18-20時間静的にインキュベートします。
手記：バイオフィルムは、μチャンネルスライドなどの他の形式で成長させることもできます(材料の表を参照)。
- 上清を吸引して、浮遊細胞を除去します。残りのバイオマスを150μLのハンクス平衡塩溶液(HBSS)で優しく洗浄し、付着していない細胞を取り除きます。バイオフィルムの破壊を避けるために、HBSSをドロップワイズに加えます.
手記：洗浄中に上清とHBSSを吸引しながら、バイオフィルムを含むウェルにバイオフィルムが浸漬されたままになるのに十分な液体(上清またはHBSS)を残します。これにより、HBSSを滴下に添加してバイオフィルムを洗浄する際に、バイオフィルムの構造が乱れるのを防ぐことができます。
- 手順1.6を少なくともさらに2回繰り返して、すべての浮遊細胞を削除します。この時点で、バイオフィルムはすぐに下流の実験を行う準備ができています
手記： バイオフィルムを好中球実験に使用しない場合は、HBSSをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で代用できます。HBSSは、好中球の活性化に最適な条件を提供するグルコースを含む成分を含んでいるため、PBSよりもHBSSが好まれます。
2. 好中球の分離
>注:好中球は、以前に公開された方法に従って分離されましたが、わずかな変更を加えました。この単離プロトコルは、最初に密度勾配遠心分離を行い、次に3%デキストラン沈降を組み合わせたものです。このセクションでは、好中球単離プロトコル全体のみを取り上げ、公開されたプロトコルに加えられた変更に焦点を当てます。さらに、以下に概説するプロトコルは、好中球を単離できる多くの方法の1つであり、必要に応じて代用することができます。好中球を単離する他の方法には、細胞分離培地の使用または磁気抗体細胞分離が含まれます。
- 施設の IRB に概説されているプロトコルに従って、静脈穿刺を介して成人ドナーから採血します。採血の前に、ヘパリンの最終濃度が20 U / mLになるように、シリンジに十分な防腐剤を含まないヘパリンが含まれていることを確認してください。.
- ヘパリン処理した血液を、室温でH2O中のエンドトキシンフリー0.9%NaCl(材料表を参照)の3/4で希釈します。.
- 希釈した血液サンプル20 mLごとに、市販の密度勾配培地14 mL(材料の表を参照)を新鮮な50 mLコニカルチューブに分注します。希釈した血液サンプルを密度勾配培地の上に慎重に重ねます。
- 層状血液サンプルを400 x gで室温で40分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、層を乱さないように、遠心分離機にゆっくりとしたブレークがあることを確認してください。
手記：血液サンプルには、生理食塩水と血漿の混合物、単核細胞層、密度勾配培地、好中球、赤血球を含む 5 つの層があります。
- 血清ピペットを使用して、好中球と赤血球ペレットの上のすべての層を吸引し、続いてペレットをH2O中の冷たいエンドトキシンフリーの0.9%NaClで穏やかに再懸濁します。20 mLの血液サンプルから生成されたペレットごとに、ペレットを合計20 mLの容量に戻します。1:1容量の3%デキストランを添加します(材料の表を参照)。チューブを直立させて氷上で18〜20分間インキュベートします.
手記：3%デキストランがH2O中のエンドトキシンフリー0.9%NaClで作られていることを確認してください。
- 好中球と一部の赤血球を含む上層の20 mLを新しい50 mLコニカルチューブに移し、355 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
- ペレットを10 mLの冷たく滅菌したH2Oに30秒間穏やかに再懸濁し、残りの赤血球を溶解します。すぐに10mLの冷たいエンドトキシンフリーの0.9%生理食塩水を混合物に加えて、緊張度を回復させます。溶液を233 x gで4°Cで3分間遠心分離します。
- 上清を注ぎ、血液サンプルの20mLあたり1mLの冷たいHBSSに95%〜97%の好中球を含むペレットを再懸濁します。.
- 再懸濁した好中球10 μLを90 μLの0.4%トリパンブルー排除色素に移し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします(材料の表を参照)
手記：トリパンブルー排除色素は生細胞に不透過性であるため、非生細胞は青色に染色されます。このプロトコルは、>99%の細胞生存率を提供します。
- 好中球の最終濃度が4 x 106細胞/mLになるように、HBSSを追加します><。
手記： 例えば、細胞生存率が<99%の場合でも、最終濃度は4 x 106細胞/mLです。ただし、得られる4 x 106細胞/ mLを含む溶液の総量は減少します。好中球の最終濃度は、ユーザーの実験ニーズに応じて調整することができます。好中球は、以下に説明するすべての実験について、4 x 106細胞/mLの最終濃度で再懸濁しました。ドナー間のばらつきを考慮するため、好中球に関するすべての実験は、少なくとも3人の異なるドナーを用いて実施することを強く推奨する。
3. バイオフィルムと好中球の相互作用のイメージング
- 手順1.2〜1.6を使用してバイオフィルムを設定します。バイオフィルムイメージングを容易にするために、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するUSA300などの黄色ブドウ球菌の蛍光株を使用して、顕微鏡イメージングの容易さを高めます><。
手記：96ウェルプレートの代わりに6 μチャンネルスライド(材料表を参照)を使用して、in vitroバイオフィルムモデルを実証しました(ステップ1)。
- 好中球4 x 106細胞/mLを100 μMのBlue CMAC(7-アミノ-4-クロロメチルクマリン)色素(BCD、材料表参照)とロッカーで37°C、5%CO2で30分間インキュベートします。サンプルが暗所でインキュベートされていることを確認し、残りのステップでは光への曝露を制限します。
- 過剰なBCDを洗浄するには、好中球を270 x gで5分間遠心分離し、上清を吸引します。好中球を新鮮なHBSSに再懸濁します。この時点で、BCD染色した好中球にエチジウムホモダイマー-1(材料の表を参照)を最終濃度4 μMで追加し、好中球と細菌の死をモニターします。
- μスライドで作製した黄色ブドウ球菌バイオフィルムに好中球150μLを添加し、好中球と細菌の比率が1:30になるようにします(好中球:細菌)。μスライドを加湿チャンバー内で30分間インキュベートします。細菌細胞の数は、18時間のバイオフィルムをプレーティングして得られる細胞数に基づいています。
- 蛍光色素/タンパク質の励起波長と発光波長に対応する蛍光チャネルを使用して、好中球とバイオフィルムの相互作用を画像化します.
手記：本研究では、BCDは353/466 nm、エチジウムホモダイマー-1は528/617 nm、GFPは395/509 nmです。サンプルの光退色を防ぐために、サンプルのレーザーまたは光への曝露を制限します。
- 顕微鏡画像解析ソフトウェアや、FIJI/ImageJ、COMSTAT2、BiofilmQ、BAITなどのプログラムを使用して画像を解析します
手記：汚れを扱う際には、使用中の染料の特異性を考慮することが重要です。原核細胞や真核細胞に作用する染色剤もあれば、片方の細胞にしか作用しない染色剤もあります。好中球とバイオフィルムを別々に染色すると、両方の細胞タイプを染色できる色素を使用して、好中球とバイオフィルムを組み合わせる前に、交差染色を防ぐために、残っている色素を洗い流してください。