動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. マウスとDSSの準備
- ノックアウト(α-gustducin-/-)マウスと年齢、性別、体重が一致した野生型コントロール(α-gustducin+/+)C57BL/6マウスを個別に清潔なケージに保管してください
手記：ノックアウトマウスは、20世代以上にわたってC57BL/6マウスと戻し交配されており、ほぼ100%のC57BL/6遺伝的背景を持っています。
- 30 gのデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)粉末を1 Lのオートクレーブ水に溶解します。溶液が透明になるまで混合して、最終作業濃度が3%(w / v)であることを確認します
手記：DSS溶液は、室温で最大1週間、または使用するまで4°Cで保存できます。
>2. マウスにおけるDSS大腸炎の誘導と評価
- 各マウスの初期体重を量り、記録します。マウスを個別に標準的なプラスチック製ケージに入れ、ケージにラベルを付けます。
- 通常の飲料水を3%DSS溶液に交換し、マウスの両方のグループが自由にアクセスできる合計7日間
。
- マウスの体重を測定し、DSS溶液の消費量を記録し、DSS投与中に各マウスの便を毎日収集して検査します。下痢と直腸出血の重症度を観察し、これをDSS誘発性疾患指数に変換します。
- 実験中、初期体重と比較した体重減少の割合と疾患指数を計算して、大腸炎の症状を評価します.
手記：疾患指数は、下痢と直腸出血の観察結果を組み合わせて採点され、0(正常な便、血液なし)、1(軟便、血液なし)、2(軟便、少量)、3(非常に軟便、中程度の出血)、および4(水様便、重大な出血)として定義されます。疾患指数は、マウスごとに毎日分析されます。
- 7日間のDSS治療の終わりまでに、子宮頸部脱臼によってマウスを犠牲にし、残りの実験を進めます。
>3. 組織サンプルの準備
- マウスを仰臥位に置き、腹部の皮膚を70%エタノールで洗浄します。腹部に長さ3cmの正中線切開を小さなハサミで行い、腹腔を露出させます。
- 一対の鉗子を使用して脾臓を他の組織から慎重に分離し、次に脾臓を取り出してそのサイズを測定します。
- 鉗子で結腸を特定して持ち上げ、周囲の腸間膜から分離します。盲腸と直腸が見えるまで結腸全体を引き出します。
- 結腸を大腸盲縁と骨盤の深部で横断して結腸を分離し、それぞれ近位結腸と遠位結腸を解放します。次に、分離された結腸の長さを測定して記録します。解剖処置中に結腸組織を傷つけないように注意してください。
- 強制針を備えた10mLのシリンジを使用して、10mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で結腸を洗い流し、溶出液が完全に透明になるまで糞便と血液を取り除きます。
- 組織学的同定のために、組織サンプルを近位、中位、遠位の3つの部分に均等に分割します。次に、組織を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で4°Cで一晩固定します。
- サイトカイン発現の解析には、結腸全体を液体窒素で急速凍結し、使用するまで-80°Cで保存します。
>4. DSS誘発性大腸炎の重症度の組織学的評価
- 免疫組織化学
- 固定後、組織を1x PBSの30%スクロース溶液に15 mLチューブで一晩浸し、サンプルを凍結保護します。
- 組織を最適な切断温度(OCT)コンパウンドに埋め込み、OCTが硬化するまで-20°Cに置きます。
- 組織を含むOCTブロックをクライオスタットに移し、クライオスタットの厚さダイヤルを12 μmに設定し、厚さ12 μmの凍結切片をスライスして収集します。
- クライオスタットから採取した組織切片を65°Cでホットプレート上で20分間加熱します。切片を1x PBSで3回、それぞれ10分間洗浄します。組織切片を3%過酸化水素で10分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼを除去します。セクションをさらに3回洗います。ブロッキングバッファー(3%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.3%非イオン性界面活性剤、2%ヤギ血清、0.1%アジ化ナトリウム(1x PBS))で室温で1時間以上組織をブロッキングします。
- ブロッキングバッファーを、免疫細胞型特異的な初代抗体であるCD45(白血球用)、CD3(T細胞用)、B220(B細胞用)、CD11b(マクロファージ用)、Ly6G(好中球用)を含む溶液で置き換えてください。4°Cで一晩インキュベートします。
- 吸引により、組織切片から一次抗体を除去します。切片を1x PBSで3回、それぞれ10分間洗浄します。ビオチン化二次抗体で切片をインキュベートした後、室温でストレプトアビジン-HRP複合体とインキュベートします。
- 切片を3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液とインキュベートして、淡褐色または暗褐色に発色し、免疫反応性細胞を可視化します。
- ヘマトキシリンと0.3%(v/v)希釈アンモニアで切片を対比染色します。顕微鏡で10倍の倍率で明視野画像を撮影します。
- 画像処理プログラムを使用して、上皮と固有層(上皮の下)の両方でマークされた免疫細胞の集団を識別し、定量化します。カラーキューブベースの機能の最初のマスクを使用して、色検出しきい値を設定し、色付きのDAB反応領域を測定します。2番目のマスクを使用して、検査されたセクションの上皮と層状固有層の合計領域を決定します。免疫反応性細胞集団は、検査された組織の全面積に対する浸潤細胞の染色領域の比率として表されます。
